《醫(yī)學遺傳學基礎》 第一節(jié)　基因定位的方法

基因定位可從家系分析、細胞、染色體和分子水平進行研究，同時由于使用手段的不同派生出多種方法，不同方法又可聯(lián)合使用，互為補充?，F(xiàn)僅就幾個主要方法加以說明。

1．體細胞雜交法體細胞是生物體除生殖細胞外的所有細胞。將從身體分離的體細胞做組織培養(yǎng)進行遺傳學研究的學科稱為體細胞遺傳學（somatic genetics）。體外培養(yǎng)細胞可人為控制或改變環(huán)境條件，并可建立細胞株，長期保存，進行各種正常和病理研究。與基因定位有關的是體細胞雜交（somatic cell hybridization）。細胞雜交又稱細胞融合（cellfusion），是將來源不同的兩種細胞融合成一個新細胞。大多數(shù)體細胞雜交是用人的細胞與小鼠、大鼠或倉鼠的體細胞（hybrid cell）進行雜交。這種新產生的融合細胞稱為雜種細胞（hybridcell)，含有雙親不同的染色體。雜種細胞有一個重要的特點是在其繁殖傳代過程中出現(xiàn)保留嚙齒類一方染色體而人類染色體則逐漸丟失，最后只剩一條或幾條，其原因至今不明。這種僅保留少數(shù)甚至一條人染色體的雜種細胞正是進行基因連鎖分析和基因定位的有用材料。由于人和鼠類細胞都有各自不同的生化和免疫學特征，Miller等運用體細胞雜交并結合雜種細胞的特征，證明雜種細胞的存活需要胸苷激酶（TK）。但凡含有人第17號染色體的雜種細胞都因有TK活性而存活，反之則死亡。從而推斷TK基因定位于第17號染色體上（圖7－1）。這是首例用細胞雜交法進行的基因定位。由此可見，研究基因定位時，由于有雜種細胞這一工具，只需要集中精力于某一條染色體上，就可找到某一基因座位。

7－1 體細胞雜交基因定位示意圖

2．克隆嵌板法（clone panel method）是應用雜種細胞保留或丟失人染色體有時有重疊現(xiàn)象而設計的一種簡便有用的基因定位方法。如表7-2所示，選擇3個都保留有4條人染色體的雜種細胞克隆，但染色體各不相同。如果某一表型特征只出現(xiàn)于克隆A、C而不見于B，就可決定該特征的基因只能在3號染色體上，因為A、C克隆都有3號染色體，而B克隆則無，其它亦可同理判斷這樣3個克隆可對8條（23=8）染色體作出判斷；如果是5個克?。?5=32）就可對人類22條常染色體和2條性染色體作出判斷。例如半乳糖激酶（GK）、尿苷-磷酸激酶（UMPK）和氨基已糖苷酶A（HEXA）的基因就是用此法分別定位于人的17號、1號和15號染色體上的。此外，還可對雜種細胞進行特殊染色，來識別雜種細胞中人和鼠染色體，以助基因定位。

表7-2 克隆嵌板示意

在體細胞雜交基礎上還發(fā)展了微細胞（micro cell）技術，即制備只含少數(shù)或一條人染色體的微細胞進行細胞雜交。也可將人中期染色體進行分離直接轉移到鼠類細胞中，使人染色體在受體細胞中裂解變成短的DNA片段，并整合到受體細胞的基因組中。如兩個基因同時整合進去，就證明它們的緊密連鎖關系。

3．原位雜交和熒光原位雜交重組DNA技術的建立與分子雜交相結合，從分子水平研究基因定位，發(fā)展了一系列有效方法。例如原位雜交（in situ hybridization）就是分子雜交技術在基因定位中的應用，也是一種直接進行基因定位的方法。分子雜交的基本原理是堿基的互補配對，同源的DNA-DNA雙鏈或DNA-RNA鏈在一定條件下能結合成雙鏈，用放射性或非放射性物質標記的DNA或RNA分子作為探針，可探測到細胞基因組中的同源部分。19770-1978年首次將分子雜交法應用于基因定位，即用α及β珠蛋白基因的cDNA為探針，與各種不同的人/鼠雜種細胞進行雜交，再對DNA雜交情況進行分析，找出cDNA探針與人染色DNA順序間的同源互補關系，從而將人α及β珠蛋白基因分別定位于第16號和第11號染色體上。

圖7-2 用原位雜交法將胰島素基因定位于11p15

原位雜交的特點是雜交在顯微鏡載玻片上中期染色體標本上進行。所謂原位即指標本上DNA原位變性，在利用放射性或非放射性標記的已知核酸探針雜交后，通過放射自顯影或非放射性檢測體系來檢測染色體上特異DNA或RNA順序，可用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強弱來確定探針的位置，從而進行準確的基因定位。圖7-2表明用此法將胰島素基因定位于11p15。但原位雜交必須在已知探針的情況下方可進行，而在未知致病基因時，則無法進行基因定位。

放射性同位素標記核酸探針與染色體顯帶結合進行原位雜交仍有不少缺點和局限性。例如需要使用放射性同位素的特殊實驗室，自顯影曝光時間長，同位素標記的探針不易保存，放射污染不利健康，特別是高質量的中期染色體標本在細胞培養(yǎng)基礎上難以得到，觀察費時，對間期核的研究難以進行等。

熒光原位雜交（florescencein-situ hybridization,FISH）是一種非放射性原位雜交方法。用特殊熒光素標記核酸（DNA）探針，可在染色體、細胞和組織切片標本上進行DNA雜交，對檢測細胞內DNA或RNA的特定序列存在與否最為有效。探針不是放射性的而是將熒光染料與抗體蛋白結合進行檢測。它們具有高度親和力，有與放射性探針相同或更高的分辯率?，F(xiàn)已可用不同的熒光染料同時進行多重原位雜交，顯示出不同的熒光色澤。這種多色FISH技術近年來發(fā)展迅速，已成為基因定位作圖和醫(yī)學診斷的重要手段。1992年運用這種策略已能在中期染色體和間期細胞同時檢測7個探針?？茖W家們的目標是實現(xiàn)24種不同顏色來觀察22條常染色體和X、Y染色體。熒光原位雜交法提高了雜交分辯率，可達100-200kb。此法降低應用于基因定位外，還有多種用途，它已日益發(fā)展成為代替常規(guī)細胞遺傳學的檢測和診斷方法，在此不多論述。

4．連鎖分析基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標記相連鎖的特點進行定位。生殖細胞在減數(shù)分裂時發(fā)生交換，一對同源染色體上存在著兩個相鄰的基因座位，距離較遠，發(fā)生交換的機會較多，則出現(xiàn)基因重組；若兩者較近，重組機會較少。重組DNA和分子克隆技術的出現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)了許多遺傳標記——多態(tài)位點，利用某個擬定位的基因是否與某個遺傳存在連鎖關系，以及連鎖的緊密程度就能將該基因定位到染色體的一定部位，使經典連鎖方法獲得新的廣闊用途，成為人類基因定位的重要手段。

染色體上兩個位點從親代傳給子代時，若相距1cM，就有1%的重組機會。整個人類基因組含3.2×109bp，相應約有3300cM，每個染色體平均約有150cM，1cM約為1000kb。因此，一個致病基因和標記位點緊密連鎖，二者不須在同一條染色體的同一區(qū)段，一條染色體可以產生大量的DNA多態(tài)，只要提供足夠的家系，按孟德爾方式遺傳的疾病都可將其基因定位。

圖7－3表示某一致病基因與一多態(tài)位點的關系。父（Ⅰ1）是顯性遺傳病患者，基因型為DN，他妻子（Ⅰ2）正常，基因型為NN，多態(tài)標記位點父為Aa,母為AA，在子代中，除Ⅱ4外，都是致病基因與多態(tài)標記位點的完全連鎖，即都遺傳了父親的A基因和D基因，或是a基因和正常N基因。據(jù)此信息，就可確證父親的致病基因是多態(tài)標記A基因連鎖在同一染色體上，而Ⅱ4則是重組體，而具有標記基因A的個體并不都是患者，Ⅰ2就是這樣，所以，在連鎖分析中，多態(tài)標記是極為有用的。

圖7-3 致病基因與標記位點的邊鎖關系圖

在人類基因組中還存在約50000－100000個串聯(lián)重復序列家族，它們均勻穿插于基因組，平均50kb有一個，這些都是很好地遺傳標記對突變的檢測和基因定位研究起了重要作用。正如本章開始提到，至1993年10月已經發(fā)現(xiàn)多態(tài)標記總數(shù)為5964個，從分子水平進行基因定位，還有不少有效的新技術，它們相互配合使用，使基因定位得到迅速發(fā)展。此外，利用染色體自身結構及染色體畸變法進行缺失作圖和基因劑量法等?？傊?，人們已不只是用單一技術進行基因定位，而是將細胞、染色體和分子水平技術結合起來，綜合分析，互相印證，以達快速、準確的目的。