《生物化學(xué)與分子生物學(xué)》 第二節(jié) 反轉(zhuǎn)錄作用(reverse transcription)

1970年Temin等在致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的DNA聚合酶，該酶以RNA為核板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序(其中V與A配對)合成DNA。這一過程與一般遺傳信息流轉(zhuǎn)錄的方向相反，故稱為反轉(zhuǎn)錄，催化此過程的DNA聚合酶叫做反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)。后來發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶不僅普遍存在于RNA病毒中，哺乳動物的胚胎細(xì)胞和正在分裂的淋巴細(xì)胞中也有反轉(zhuǎn)錄酶。

反轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在tRNA3′桹H末端上，按5′→3′方向，合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補(bǔ)DNA(complementary DNA, cDNA)，它與RNA模板形成RNA桪NA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導(dǎo)的DNA合成過程(圖16－17)。

圖16－17　反轉(zhuǎn)錄酶催化的反轉(zhuǎn)錄作用

攜帶反轉(zhuǎn)錄酶的病毒又稱為反轉(zhuǎn)錄病毒，它侵入宿主細(xì)胞后先以病毒RNA為模板靠反轉(zhuǎn)錄酶催化合成DNA，隨后這種DNA環(huán)化并整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA中去，以原病毒(provirus)的形式在宿主細(xì)胞中一代代傳遞下去。以后又發(fā)現(xiàn)許多反轉(zhuǎn)錄病毒基因組中都含有癌基因(oncogene)，如果由于某種因素激活了癌基因就可使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞。(將在專門一章中敘述)。

大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性。①DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。②RNase H活性；由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。除此之外，有些反轉(zhuǎn)錄酶還有DNA內(nèi)切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中有關(guān)。反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)對于遺傳工程技術(shù)起了很大的推動作用，目前它已成為一種重要的工具酶。用組織細(xì)胞提取mRNA并以它為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成出互補(bǔ)的DNA(cDNA)，由此可構(gòu)建出cDNA文庫(cDNa library)，從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術(shù)中最常用的獲得目的基因的方法，詳見基因工程一章。