《生物化學(xué)與分子生物學(xué)》 (四)DNA的變性、復(fù)性與分子雜交

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，不僅與其生物功能有密切關(guān)系，還能解釋DNA的重要特性棗變性與復(fù)性，這對于深入了解DNA分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系又有重要意義。

1.DNA變性(denaturation)

指DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。變性時維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，如加熱、極端的pH、有機(jī)試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子變性。變性DNA常發(fā)生一些理化及生物學(xué)性質(zhì)的改變：

溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的剛性結(jié)構(gòu)，變性后代之以柔軟而松散的無規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，DNA粘度因此而明顯下降。

溶液旋光性發(fā)生改變。變性后整個DNA分子的對稱性及分子局部的構(gòu)性改變，使DNA溶液的旋光性發(fā)生變化。

15－8　核酸的解鏈曲線

增色效應(yīng)(hyperchromiceffect)。指變性后DNA溶液的紫外吸收作用增強(qiáng)的效應(yīng)。DNA分子中堿基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長紫外光的特性。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基藏入內(nèi)側(cè)，變性時DNA雙螺旋解開，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。

對雙鏈DNA進(jìn)行加熱變性，當(dāng)溫度升高到一定高度時，DNA溶液在260nm處的吸光度突然明顯上升至最高值，隨后即使溫度繼續(xù)升高，吸光度也不再明顯變化。若以溫度對DNA溶液的紫外吸光率作圖，得到的典型DNA變性曲線呈S型(圖158)?？梢奃NA變性是在一個很窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的。通常將核酸加熱變性過程中，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時的溫度稱為核酸的解鏈溫度，由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解相類似，又稱融解溫度(Tm,meltingtemperature)。在Tm時，核酸分子內(nèi)50%的雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。特定核酸分子的Tm值與其G＋C所占總堿基數(shù)的百分比成正相關(guān)，兩者的關(guān)系可表示為：

Tm=69.3＋0.41(%G+C)

一定條件下(相對較短的核酸分子)，Tm值大小還與核酸分子的長度有關(guān)，核酸分子越長，Tm值越大；另外，溶液的離子強(qiáng)度較低時，Tm值較低，融點范圍也較寬，反之亦然，因此DNA制劑不應(yīng)保存在離子強(qiáng)度過低的溶液中。

2.DNA復(fù)性(renaturation)

指變性DNA在適當(dāng)條件下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱之為退火(annealing)。這一術(shù)語也用以描述雜交核酸分子的形成(見后)。DNA的復(fù)性不僅受溫度影響，還受DNA自身特性等其它因素的影響：

溫度和時間。一般認(rèn)為比Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件，越遠(yuǎn)離此溫度，復(fù)性速度就越慢。復(fù)性時溫度下降必須是一緩慢過程，若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下)，復(fù)性幾乎是不可能的，核酸實驗中經(jīng)常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態(tài)。這說明降溫時間太短以及溫差大均不利于復(fù)性。

DNA濃度。溶液中DNA分子越多，相互碰撞結(jié)合的機(jī)會越大。

DNA順序的復(fù)雜性。簡單順序的DNA分子，如多聚(A)和多聚(U)這二種單鏈序列復(fù)性時，互補(bǔ)堿基的配對較易實現(xiàn)。而順序復(fù)雜的序列要實現(xiàn)互補(bǔ)，則困難得多。在核酸復(fù)性研究中，定義了一個Cot的術(shù)語，(Co為單鏈DNA的起始濃度，t是以秒為單位的時間)，用以表示復(fù)性速度與DNA順序復(fù)雜性的關(guān)系。在探討DNA順序?qū)?fù)性速度的影響時，將溫度、溶劑離子強(qiáng)度、核酸片段大小等其它影響因素均予以固定，以不同程度的核酸分子重締合部分(在時間t時的復(fù)性率)對Cot作圖，可以得到如圖15－9所示的曲線。曲線上方為示復(fù)雜性的核酸分子的非重復(fù)堿基對數(shù)。如多聚(A)的復(fù)雜性為1，重復(fù)的(ATGC)n組成的多聚體的復(fù)雜性為4，分子長度是105核苷酸對的非重復(fù)DNA的復(fù)雜性為105。原核生物基因組均為非重復(fù)順序，故以非重復(fù)核苷酸對表示的復(fù)雜性直接體現(xiàn)基因組大小(圖上方的箭頭所指為基因大小)，對于真核生物基因組中的非重復(fù)片段也是如此。在標(biāo)準(zhǔn)條件下(一般為0.18ml/L陽離子濃度，400核苷酸長的片段)測得的復(fù)性率達(dá)0.5時的Cot值(稱Cot1/2)，與核苷酸對的復(fù)雜性成正比。對于原核生物核酸分子，此值可代表基因組的大小及基因組中核苷酸對的復(fù)雜程度。真核基因組中因含有許多不同程度的重復(fù)序列(repetitive sequence)，所得到的Cot曲線更為復(fù)雜。

圖15－9　不同物種核酸的Cot曲線

DNA的變性和復(fù)性原理，現(xiàn)已在醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)上得到廣泛的應(yīng)用。如核酸雜交與探針技術(shù)，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechain reaction,PCR)技術(shù)等。

3.分子雜交：(hybridization)

不同來源的核酸變性后，合并在一處進(jìn)行復(fù)性，這時，只要這些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成堿基互補(bǔ)配對的片段，復(fù)性也會發(fā)生于不同來源的核酸鏈之間，形成所謂的雜化雙鏈(heterodup lex)，這個過程稱為雜交(hybridization)圖15-10，I)。雜交可以發(fā)生于DNA與DNA之間，也可以發(fā)生于RNA與RNA之間和DNA與RNA之間。例如，一段天然的DNA和這段DNA的缺失突變體(假定這種突變是DNA分子中部丟失了若干堿基對)一起雜交，電子顯微鏡下可以看到雜化雙鏈中部鼓起小泡。測量小泡位置和長度，可確定缺失突變發(fā)生的部位和缺失的多少。核酸雜交技術(shù)是目前研究核酸結(jié)構(gòu)、功能常用手段之一，不僅可用來檢驗核酸的缺失、插入，還可用來考察不同生物種類在核酸分子中的共同序列和不同序列以確定它們在進(jìn)化中的關(guān)系。其應(yīng)用當(dāng)然遠(yuǎn)不止于確定突變位置這一例(圖15－10Ⅱ)。

圖15－10　核酸雜交及其應(yīng)用示意圖

Ⅰ.變性、復(fù)性和雜交。粗細(xì)線分別代表不同DNA。A是雜化雙鏈

Ⅱ.突變體的鑒別。B代表天然DNA；C是B的缺失突變體；虛線框內(nèi)是已缺失的部分；

D是顯示從天然DNA鏈鼓出小泡?、?粗線代表探針，粗線上的X表示放射性標(biāo)記

在核酸雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種用于研究和診斷的非常有用的技術(shù)稱探針技術(shù)(Probe)。一小段(例如十?dāng)?shù)個至數(shù)百個)核苷酸聚合體的單鏈，有放射性同位素如32P、35S或生物素標(biāo)記其末端或全鏈，就可作為探針。把待測DNA變性并吸附在一種特殊的濾膜，例如硝酸纖維素膜上。然后把濾膜與探針共同培育一段時間，使發(fā)生雜交。用緩沖液沖洗膜。由于這種濾膜能較牢固地吸附雙鏈的核酸，單鏈的在沖洗時洗脫了。帶有放射性的探針若能與待測DNA結(jié)合成雜化雙鏈，則保留在濾膜上。通過同位素的放射自顯影或生物素的化學(xué)顯色，就可判斷探針是否與被測的DNA發(fā)生雜交。有雜交現(xiàn)象則說明被測DNA與探針有同源性(homogeneity)，即二者的堿基序列是可以互補(bǔ)的。例如：想知道某種病毒是否和某種腫瘤有關(guān)，可把病毒的DNA制成探針。從腫瘤組織提取DNA，與探針雜交處理后，有雜化雙鏈的出現(xiàn)，就說明兩種DNA之間有同源性。這不等于可以說這種病毒引起腫瘤，但至少這是可以繼續(xù)深入研究下去的一條重要線索。

探針技術(shù)(圖15－10Ⅲ)在遺傳性疾病診斷上已開始應(yīng)用。例如診斷地中海貧血或血紅蛋白病，可以由已確診的病人白細(xì)胞中提取DNA，這就是診斷探針。用診斷探針檢查，不但可以對有癥狀患者進(jìn)行確診，還可以發(fā)現(xiàn)一些沒有癥狀的隱性遺傳性疾病。從胎兒的羊水也可以提取到少量DNA。由于探針技術(shù)比較靈敏，就使遺傳性疾病的產(chǎn)前診斷較為容易辦得到了。雜交和探針技術(shù)是許多分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究中，以及臨床診斷中得到了日益廣泛的應(yīng)用。