《免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)》 第三節(jié)　腫瘤壞死因子的檢測

一、生物學(xué)檢測法

TNF的主要生物學(xué)活性之一就是對某些腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。根據(jù)這一特點(diǎn)，可利用TNF敏感的靶細(xì)胞測定TNF活性，根據(jù)細(xì)胞死亡得出TNF的相對活性。該法的關(guān)鍵是選擇敏感特異的靶細(xì)胞。靶細(xì)胞可以是長期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系，也可以是新鮮分離的原代細(xì)胞（如瘤細(xì)胞）?，F(xiàn)以貼壁生長的L929細(xì)胞為例，簡述TNF活性的檢測原則。

兩種TNF均可傷體外培養(yǎng)的L929細(xì)胞，細(xì)胞死亡率與TNF活性成正比。某些染料如中性紅、結(jié)晶紫等能使活細(xì)胞染上相應(yīng)顏色，再用脫色液將染料脫出，通過測定其吸亮度值間接監(jiān)沒細(xì)胞存活狀態(tài)。

試驗(yàn)原則是收集對數(shù)生長期的L929細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞至適當(dāng)濃度，加入培養(yǎng)板小孔中，置37℃，5％CO2溫箱中培養(yǎng)16～24h，換液后，在各孔中加入不同稀釋度的待檢樣品，再加適當(dāng)濃度的放線菌素D和適量培養(yǎng)液，繼續(xù)溫育16～24h，棄培養(yǎng)液，經(jīng)Hanks液洗滌后，每孔加入適當(dāng)濃度的結(jié)晶紫染色液，37℃培養(yǎng)1h，使活細(xì)胞充分著色。然后各孔加1％SDS短時(shí)溫育使染色細(xì)胞溶解，再以酶標(biāo)測定儀測各孔A570nm值。每次檢測均設(shè)培養(yǎng)液（陰性）對照和不同濃度的rTNF（陰性）對照。以使陰性對照50％細(xì)胞溶解的標(biāo)本最大稀釋倍數(shù)為TNF活性單位，以u/ml表示。

由于放線菌素D能抑制DNA的合成、降低靶細(xì)胞對損傷的修復(fù)機(jī)制，因而在檢測中加入放線素D可使靶細(xì)胞對TNF的敏感性增高10～200倍。

二、免疫學(xué)檢測法

通常采用ELISA，該法特異性高、敏感性強(qiáng)且快速使捷，而且能夠區(qū)別TNFα和TNFβ，為臨床檢測病人血清中TNF水平的有效方法，但不能反映TNF活性。

三、其它檢測法

檢測TNF還可用生物發(fā)光法及NAG微量酶反應(yīng)比色法。這類方法是應(yīng)用生化技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)代謝的變化，從而推知靶細(xì)胞功能變化及死亡情況。其優(yōu)點(diǎn)是不僅反映細(xì)胞的死亡情況，而且能反映細(xì)胞的功能變化。此外，還具有快速、方便、微量的特點(diǎn)。