《免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗》 一、溶血反應(yīng)的檢測試劑

（一）補體

檢測血清補體水平或補體活性時需要從受檢者采血及分離血清。做補體結(jié)合試驗時多采用豚鼠血清作為實驗用補體的來源。因為補體在體外極易衰變，所以檢測補體活性的血清標本和作為補體試劑的血清必須新鮮。

受檢者一般做靜脈采血，在動物可做心臟采血。血清分離后應(yīng)及時使用，最好在當日用完。必須保存時采用小量分裝的辦法，置－70℃下可保存數(shù)月，避免反復(fù)凍融。凍干制品可長期保存，但其活性都不同程度地比新鮮血清降低。

以豚鼠血清作補體來源時，應(yīng)考慮到個體差異。為了確保血清中補體的有效活性，必須取3只以上豚鼠的血清混合后使用。

（二）綿羊紅細胞

從綿羊頸靜脈無菌采血，抽出血液后立即小心地注入放有玻璃珠的無菌干燥三角燒瓶中，充分旋搖15～20min，以除去纖維蛋白。也可將羊血與等量或2倍量的Alsever血液保存液混合，既有抗凝作用，又適于儲存；分裝后置4℃，可使用3周。

實驗前，取適量抗凝血，加入8～10倍的生理鹽水，輕輕混勻后2000r/min離心5min；棄上清，沉淀的紅細胞用生理鹽水再洗一次，這時上清為無色澄清，如顯紅色說明有溶血現(xiàn)象，應(yīng)更換新鮮羊血；第三次用緩沖液洗滌，棄上清，取壓積紅細胞用緩沖液配制SRBC懸液，使用濃度一般為2％～5％。為使紅細胞濃度標準化，可吸取少量紅細胞懸液，中入20～30倍的稀釋液中，在542nm波長比濁，以吸光度為標準調(diào)整紅細胞濃度。

（三）溶血素

溶血素即抗綿羊紅細胞抗體，多是以綿羊紅細胞免疫家兔而得到兔抗血清。一般沒有必要進一步提純抗體，但在試驗前需先進行加熱56℃30min或60℃3min以滅活補體。

由于補體溶血試驗及補體結(jié)合試驗均是比較精密的試驗，其結(jié)果與溶血素的效價有關(guān)，所以試驗需要滴定溶血素效價；在制備抗血清的過程中，于動物采血前和分離抗血清后也需要滴定溶血素效價。

1．溶血素稀釋稀釋溶血素時，要先對效價有個大概的估計，以便確定稀釋度的范圍。動物采血前滴定時稀釋范圍要稍大些，實驗前的滴定便以原先的記錄作為參考（溶血素的效價多在數(shù)千單位以上）。溶血素稀釋一般不采用連續(xù)倍比稀釋法，因為稀釋到最后時跨度太大，不容易確定單位。為了便于操作，現(xiàn)舉例按表14-1配制不同稀釋度的溶血素。

表14-1不同濃度溶血素的配制

最終稀釋度緩沖液（ml）所加溶血素稀釋度體積（ml）1:10001.81:1000.21:20000.21:10000.21:30000.41:10000.21:40000.21:20000.21:50000.81:10000.21:60000.21:30000.21:80000.21:40000.21:100000.21:50000.2

2．效價滴定將稀釋好的溶血素及其他試劑按表14-2所示逐步加入到各試管中，放置37℃水浴，不要蓋上水浴箱的蓋子，以免蓋子上冷凝的水蒸氣滴入試管內(nèi)引起非補體性溶血。30min后取出觀察結(jié)果。

表14-2溶血素的滴定

管號溶血素稀釋度試管內(nèi)加的各種試劑材料結(jié)果溶血素(ml)1:60稀釋補體(ml)緩沖液(ml)20％羊紅細胞(ml)11:10000.10.20.20.1全溶21:20000.10.20.20.1全溶31:30000.10.20.20.1全溶41:40000.10.20.20.1全溶51:50000.10.20.20.1大部分61:60000.10.20.20.1微溶71:80000.10.20.20.1不溶81:100000.10.20.20.1不溶9(對照)－－0.50.1不溶

溫育反應(yīng)后，完全溶血的試管內(nèi)液體紅色透明，放置一段時間后管底無細胞沉淀，離心后可見少許細胞碎渣。不溶血的管內(nèi)液體渾濁；放置后可見紅細胞沉淀，上清無色透明。不同程度的不完全溶血介于兩者的中間變化態(tài)。

按照以上標準，以產(chǎn)生完全溶血的最高稀釋管為最大有效反應(yīng)管，以該管的溶血素稀釋倍數(shù)為溶血素產(chǎn)效價。例如表14-2中的溶血素效價應(yīng)為1:4000；在1:4000稀釋的情況下，反應(yīng)液中所含溶血素的的量為1U/ml。

做補體活性測定或補體結(jié)合試驗時，一般使用2U/ml溶血素（在本例做1:2000稀釋），與SRBC懸液等體積混合。

（四）稀釋緩沖液

磷酸緩沖液或巴比妥緩沖液等均可用于溶血試驗，pH值應(yīng)調(diào)至7.2～7.4之間。另加入適量氯化鈉以保持等滲，并適當?shù)丶尤胍恍┾}離子和鎂離子，這是補體活化所不可缺少的。有的配方還加入0.1％的明膠以使蛋白溶液穩(wěn)定；加入0.01％NaN3可以防腐，利于較長時間保存。