《臨床生物化學(xué)》 二、光譜分析的常用方法

（一）吸收光譜分析法

1、可見(jiàn)光及紫外光分光亮度法

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法：將一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照一定操作過(guò)程顯色后，分別測(cè)吸亮度，以吸亮度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下處理待測(cè)物質(zhì)并測(cè)定其吸亮度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線找出相對(duì)應(yīng)的濃度。

（2）對(duì)比法：將標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測(cè)樣品在相同條件下顯色并測(cè)定各自的吸亮度。由于測(cè)定體系溫度、厚度以及入射光波長(zhǎng)是一致的，所以標(biāo)準(zhǔn)與待測(cè)樣品K值及L相等，可應(yīng)用下式比較計(jì)算待測(cè)樣品濃度：Cx=Cs×As／Ax。

（3）差示法：有色溶液濃度太濃或太稀（透光度超過(guò)90%-10%）時(shí)，測(cè)定結(jié)果會(huì)產(chǎn)生較大誤差，此時(shí)可采用差示法（differentialspectrophotometry)。①高濃度樣液差示法：用標(biāo)準(zhǔn)品制備濃度稍低于試樣的參比溶液，先將儀器光門(mén)關(guān)閉，調(diào)節(jié)T%=0，再將參比溶液置于光路上，打開(kāi)光門(mén)使T%=100，然后測(cè)定樣品溶液的透光率即可。例如某一樣品溶液原來(lái)的透光率讀數(shù)為5%（10%以下），用差示法后讀數(shù)為50%，這實(shí)質(zhì)是把透光率標(biāo)尺擴(kuò)展了10倍，從而減少了測(cè)量誤差。②低濃度樣液差示法：用標(biāo)準(zhǔn)品制備濃度稍高于試樣的參比溶液，將它放在光路上，打開(kāi)光門(mén)，調(diào)節(jié)透光率至0%，然后換以空白溶劑，調(diào)節(jié)刻度至100%。此后測(cè)定樣品的讀數(shù)即可。

（4）多組分混合物的測(cè)定：當(dāng)試樣中有兩種或兩種以上的組分共存，可根據(jù)各組分的吸收光譜的重疊程度，選用不同的定量方法。如果混合物各組分的吸收峰互不干擾，這時(shí)可按單組分的測(cè)定方法，選擇測(cè)定波長(zhǎng)，分別測(cè)定各組分的含量；若各組分的吸收峰相互重疊，可采用解聯(lián)立方程法、等吸收點(diǎn)法、雙波長(zhǎng)法等解決量中的干擾問(wèn)題。

（5）利用摩爾吸光系數(shù)進(jìn)行檢測(cè)：①吸光系數(shù)：Beer定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式為A=kbc，若溶液的濃度c以g/L為單位，b為光徑以cm為單位，則常數(shù)K稱為吸光系數(shù)，以a表示，其單位為升/（克·厘米）[L/(g·cm],A=kbc可寫(xiě)成A=abc。②摩爾吸光系數(shù)：公式A=kbc中的以為1mol/L,b為1cm時(shí)，則系數(shù)k稱為摩爾吸光系數(shù)，以ε表示，單位為升/（摩爾·厘米）[L/(mol·cm）]，A=kbc可寫(xiě)成A=εc。在實(shí)際工作中，不能直接用1mol/L這種高濃度的溶液測(cè)定吸光度，而是在稀釋成適當(dāng)濃度時(shí)測(cè)定吸光度進(jìn)行運(yùn)算。ε值與入射光波長(zhǎng)、溶液的性質(zhì)等因素有關(guān)。如NADH在260nm時(shí)ε為15000，寫(xiě)成ε260NADH=15×103；在340nm時(shí)ε為6220，寫(xiě)成ε340NADH=6.22×103。③比吸光系數(shù)：如公式A=kbc中的c是百分濃度（w/v）b為cm，則常數(shù)k可用E%表示，稱為比吸光系數(shù)或百分吸光系數(shù)，A=kbc可寫(xiě)成A=E%bc。當(dāng)待測(cè)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)是已知者可用ε值分析，若所測(cè)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)是未知的，則ε無(wú)法確定，此時(shí)用比吸光系數(shù)分析就很方便。a、ε和E常用作粗定量分析，主要用于定性分析。

近年來(lái)由于新的靈敏度高、選擇性好的顯色劑和掩蔽劑不斷出現(xiàn)，一般不經(jīng)分離過(guò)程即可直接比色測(cè)定。幾乎所有的無(wú)機(jī)離子和有機(jī)物都可直接或間接用可見(jiàn)光及紫外光分光光度法進(jìn)行定量測(cè)定。

2、原子吸收分光光度法　原子吸收光光度法是基于元素所產(chǎn)生的原子蒸氣中，待測(cè)元素的基態(tài)原子，對(duì)所發(fā)射的特征譜線的吸收作用進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)。具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)大部分元素，其靈敏度約為10-8～10-10g/ml，是微量元素檢測(cè)的一個(gè)十分有鏟的方法之一。

（1）分析條件的選擇

1）分析線：原子吸收法中常選擇待測(cè)元素的共振作分析線，但并不是任何情況下都應(yīng)使用共振線，例如As、Se、Hg的共振線在遠(yuǎn)紫外區(qū)，該區(qū)域火焰吸收強(qiáng)烈，不宜選用共振線作分析線。在選擇分析線時(shí)，首先掃描空心陰極燈的發(fā)射光譜，然后噴入試樣溶液，觀察譜線的吸收和干擾情況，一般選用不受干擾且吸收最強(qiáng)的譜線作為分析線。常用元素分析線見(jiàn)表16-1。

表16-1　常用元素分析線

元素分析線元素分析線元素分析線Al3093.3082Ca4227.2309Cd2288.3261Cu3248.3274Fe2483.3523Hg2537K7665.7699Mg2852.2796Na5890.3303Pb2167.2833Sn2246.2796Zm21393.3076

2）狹縫寬度的選擇：適宜狹縫寬度可由實(shí)驗(yàn)確定：將試樣噴入火焰，調(diào)節(jié)狹縫寬度，測(cè)定不同狹縫寬度時(shí)的吸光度，達(dá)到一定寬度后，吸光度趨于穩(wěn)定，進(jìn)一步增加狹縫寬度，當(dāng)其他譜線或非吸收透過(guò)狹縫時(shí)，吸光度立即減小。不引起吸光度減小的最大狹縫寬度，就是最適宜的狹縫寬度。

3）原子化條件的選擇：對(duì)于火焰原子化法，火焰的種類(lèi)和燃助比的選擇是很重要的。當(dāng)燃?xì)夂椭細(xì)膺x擇好后，可通過(guò)下述方法選擇燃助比：固定助燃?xì)饬髁浚淖內(nèi)細(xì)饬髁?，測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同燃助比時(shí)的吸光度，繪制吸光度-燃助比關(guān)系曲線，以確定最佳燃助比。

對(duì)于石墨爐原子化器的使用。應(yīng)注意干燥是一個(gè)低溫去溶劑的過(guò)程，可在稍低于溶劑沸點(diǎn)的溫度下進(jìn)行?；一菫榱似茐暮腿コ嚇踊w，故在保證試樣無(wú)明顯損失的前提下，將試樣加熱到盡可能高的溫度。原子化階段應(yīng)選擇最大吸收信號(hào)的最低溫度?？傊鶕?jù)試樣的性質(zhì)確定各階段所選定的溫度與加熱時(shí)間。

4）試樣量的選擇：火焰原子化法在一定范圍內(nèi)，噴入的試樣量增加，原子吸光度增大，但在超過(guò)一定量后，由于試樣不能完全有效地原子化及試液的冷卻效應(yīng)會(huì)使吸光度不再增大甚至有所下降。因此在保持一定的火焰條件下，測(cè)定吸光度隨噴入試樣量的增加達(dá)到最大吸光度時(shí)的噴霧量，就是適宜的試樣量。石墨爐原子化一般固體取樣0.1～10mg，液體取樣量為1～50μl，主要依石墨管容器的大小而定。

（2）定量方法：常用的定量方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)加入法和內(nèi)標(biāo)法。

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法：同紫外可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線法。但由于燃?xì)饬髁亢蛧婌F效率的變化，單色器波長(zhǎng)的漂移等因素可導(dǎo)致樣品測(cè)試條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定條件不同，所以，在測(cè)定未知樣品時(shí)，應(yīng)隨時(shí)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢查，每次實(shí)驗(yàn)都要重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）標(biāo)準(zhǔn)加入法：在標(biāo)準(zhǔn)曲線法中，一般情況下要求標(biāo)準(zhǔn)溶液和未知溶液的組成保持一致。但在實(shí)際工作中不是總能做到的，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法可以克服這個(gè)缺點(diǎn)。本法把未知試樣溶液分成體積相同的若干份，留其中一份，其余分別加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，然后測(cè)定各溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品加入量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖16-1）。由于未知樣品中含待測(cè)組分，故直線不通過(guò)原點(diǎn)而是在吸光度高于原點(diǎn)的A處與縱軸相交，且直線外推法使工作曲線延長(zhǎng)交橫軸處于B點(diǎn)，則OB所對(duì)應(yīng)的濃度Cx就是未知試樣中待測(cè)組分濃度。

圖16-1 標(biāo)準(zhǔn)加入法工作曲線

標(biāo)準(zhǔn)加入法的優(yōu)點(diǎn)是能夠更好地消除樣品中其它成分對(duì)測(cè)定的影響。

3）內(nèi)標(biāo)法：在系列標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品中加入一定量試樣中不存在的元素（內(nèi)標(biāo)元素），然后測(cè)得As和Ax，以As/Ax比值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品中待測(cè)元素濃度C繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)未加內(nèi)標(biāo)元素的試樣A與加入內(nèi)標(biāo)元素的試樣As比值（A/As）即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得試樣中待測(cè)元素濃度。

本法要求內(nèi)標(biāo)元素應(yīng)與待測(cè)元素有相近的物理和化學(xué)性質(zhì)。此外，內(nèi)標(biāo)法只適用于雙通道型原子吸收分光光度計(jì)。

（二）發(fā)射光譜分析法

1、熒光分析法　許多物質(zhì)都是光致發(fā)光的，即它們可以吸收電磁輻射，然后又重新發(fā)射出相同或較長(zhǎng)波長(zhǎng)的輻射。光致發(fā)光最常見(jiàn)的類(lèi)型是熒光（fluorescence)和磷光（phosphorescence）。利用熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析的方法，稱為熒光法（fluorimetry)。在熒光分析中，待測(cè)物質(zhì)分子成為激發(fā)態(tài)時(shí)所吸收的光稱為激發(fā)光，處于激發(fā)態(tài)的分子回到基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的熒光稱發(fā)射光。熒光法測(cè)定的是受光激發(fā)后所發(fā)射的熒光的強(qiáng)弱，而不是測(cè)定激發(fā)光的強(qiáng)弱。凡能產(chǎn)生熒光的化合的，均可采用熒光分析法進(jìn)行定性或定量。

（1）熒光強(qiáng)度的影響因素

1）溶劑：增大溶劑的極性，將使π-π※躍遷的能量降低，熒光增強(qiáng)。在水、乙醇、環(huán)已烷等這些常用溶劑中常含有熒光雜質(zhì)，影響測(cè)定，必須在使用前作凈化處理。

2）熒光物質(zhì)的濃度：對(duì)于某一熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定頻率和一定強(qiáng)度的放射光Ⅰ。照射下，如果光被吸收的百分率不太大，且溶液的濃度很小，當(dāng)溶液的厚度不變時(shí)，則它所發(fā)生的熒光強(qiáng)度F和該溶液的濃度C成正比，即F=φⅠ。ECL式中φ為熒效率。當(dāng)熒光物質(zhì)濃度高時(shí)，會(huì)發(fā)生分子間碰撞，使熒光效率降低。因?yàn)闇囟仍龈吆笫狗肿娱g碰撞次數(shù)增加，消耗分子的內(nèi)部能量。

3）溫度：大多數(shù)情況隨溫度升高時(shí)，熒光效率降低。因?yàn)闇囟仍龈吆笫狗肿娱g碰撞次數(shù)增加，消耗分子的內(nèi)部能量。

4）溶液的PH值：當(dāng)熒光物質(zhì)本身為弱酸或弱堿時(shí)，溶液的pH值改變對(duì)溶液熒光強(qiáng)度產(chǎn)生影響較大，因?yàn)橛行┪镔|(zhì)在離子狀態(tài)時(shí)無(wú)熒光，而有些則相反，也有二者均有熒光，但熒光光譜有所不同。

（2）熒光定量分析法：熒光定量分析法通常有標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法。操作和計(jì)算可參照比色法，但應(yīng)注意，空白溶液的熒光強(qiáng)度F。往往不在零點(diǎn)，用上述兩種方法時(shí)應(yīng)先測(cè)定F，再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)品Fs和試樣Fx中減去F。后進(jìn)行計(jì)算。

多組分混合物在熒光分析也可根據(jù)熒光峰相距情況采取不同的方法，如各組分熒光峰相距頗遠(yuǎn)，可分別在不同波長(zhǎng)測(cè)定各個(gè)組分的熒光強(qiáng)度，然后直接求出各組分濃度。如果各組分熒光光譜相互重疊，利用熒光強(qiáng)度的加和性質(zhì)，在適宜熒光波長(zhǎng)處，測(cè)得混合物的熒光強(qiáng)度，再根據(jù)被測(cè)物質(zhì)各自在適宜波長(zhǎng)處的最大熒光強(qiáng)度，列出聯(lián)立方程式求算各自的含量。

對(duì)較高濃度的熒光物質(zhì)可用差示熒光法測(cè)定。

（3）熒光分析技術(shù)的應(yīng)用：熒光分析法靈敏度高，選擇性好、取樣量少，因此已廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，在臨床生化檢驗(yàn)方面可用于某些無(wú)機(jī)物與有機(jī)物的分析。

無(wú)機(jī)化合物能直接產(chǎn)生熒光并用于測(cè)定的為數(shù)不多，但與有機(jī)試劑絡(luò)合后進(jìn)行熒光分析的元素已達(dá)60余種，常見(jiàn)無(wú)機(jī)物的熒光測(cè)定見(jiàn)表16-2。

表16-2　常見(jiàn)無(wú)機(jī)物的熒光測(cè)定

元素?zé)晒庠噭┘ぐl(fā)波長(zhǎng)（nm）熒光波長(zhǎng)（nm）靈敏度（μg/ml）Ag四氯熒光素5405800.1Al桑色素4305000.1Br熒光素4404700.002Ca乙二醛-雙-（4-羥芐基腙）4535230.0004Cl熒光素+AgNO32545050.002CN2',7'-雙（乙酸基汞）熒光素5006500.1Fe曙紅+1，10-二氮雜非5405800.1Pb曙紅+1，10-二氮雜非5405800.1Zn8-羥基喹啉3655200.5F石榴茜互R-AI絡(luò)合物4705000.001

某些有機(jī)化合物的熒光測(cè)定應(yīng)用較多，如糖類(lèi)、胺類(lèi)、甾族化合物、DNA與RNA、酶與輔酶、維生素等。常見(jiàn)有機(jī)化合物的熒光測(cè)定法見(jiàn)表16-3。

表16-3 常用有機(jī)化合物熒光測(cè)定法

待測(cè)物試劑激發(fā)波長(zhǎng)（nm）熒光波長(zhǎng)（nm）靈敏度（μg/ml）核酸溴化乙啶360-365580-5900.1蛋白質(zhì)曙紅y紫外5400.06氨基酸氧化酶等3154250.01腎上腺素乙二胺4205250.001NAD（P）H自身為熒光物質(zhì)34045010-6mol/LATP已糖激酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、6-磷酸葡萄糖3404502×10-6mol/L維生素A無(wú)水乙醇3454900.001

2、火焰光度法火焰光度法是利用火焰中激發(fā)態(tài)原子回降至基態(tài)時(shí)發(fā)射的光譜強(qiáng)度進(jìn)行含量分析的方法。它在儀器結(jié)構(gòu)和分析操作上與火焰原子吸收法相似。

在火焰光度法中，試液和助燃?xì)庖黄疬M(jìn)入霧化室，霧化后噴入火焰，霧粒在火焰中蒸發(fā)和激發(fā)，激發(fā)態(tài)原子降落到低能態(tài)時(shí)發(fā)生光輻射，經(jīng)單色器分光后到達(dá)檢測(cè)器，然后由顯示系統(tǒng)顯示其發(fā)射光強(qiáng)度。

試樣中的待測(cè)元素激發(fā)態(tài)原子的發(fā)射光強(qiáng)度Ｉ與該元素濃度C成正比關(guān)系，即I=aC。式中a為常數(shù)。a與試樣的組成、蒸發(fā)和激發(fā)過(guò)程有關(guān)。

火焰光度法同樣存在各種因素干擾，如供氣壓力，試樣導(dǎo)入量、有機(jī)溶劑和無(wú)機(jī)酸的影響，以及金屬元素間的相互作用等，某些干擾因素的消除方法同原子吸收法。對(duì)于金屬離子間的相互作用可以下述方法予以消除：

（1）陽(yáng)離子的干擾：第二陽(yáng)離子的存在可使待測(cè)陽(yáng)離子的電離作用降低而導(dǎo)致以元素形式存在居多，結(jié)果發(fā)射強(qiáng)度增大，這種現(xiàn)象稱為陽(yáng)離子增強(qiáng)效應(yīng)。例如測(cè)定鈣時(shí)有鉀存在，鉀可抑制鈣的電離，干擾鈣的測(cè)定。消除這種干擾的辦法是在標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣中加入本身易電離的金屬如銫和鋰。

（2）陰離子干擾：草酸根、磷酸根和硫酸根可與某些陽(yáng)離子在火焰溫度下形成僅能緩慢蒸發(fā)的化合物而抑制原子激發(fā)，結(jié)果導(dǎo)致待測(cè)元素發(fā)射強(qiáng)度降低。消除這種干擾的辦法是用釋放劑。釋放劑的作用是同干擾陰離子牢固結(jié)合，使待測(cè)陽(yáng)離子的激發(fā)行為不受干擾，或與待測(cè)陽(yáng)離子形成更穩(wěn)定而易揮發(fā)的配合物。故盡量避免使用磷酸、硫酸、草酸做試劑。

此外，應(yīng)避免環(huán)境污染測(cè)試體系。使用的器皿應(yīng)為塑料制品以防止玻璃器皿中金屬溶出干擾測(cè)定。

火焰光度法通常采用的定量方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)加入法和內(nèi)標(biāo)法。臨床檢驗(yàn)工作中前兩種應(yīng)用較多，而且測(cè)定血液或血清中鈉和鉀已成常規(guī)。應(yīng)用火焰光度法測(cè)定某些元素的波長(zhǎng)及檢測(cè)限見(jiàn)表16-4。

表16-4 火焰光度法測(cè)定某些元素的波長(zhǎng)與檢測(cè)限

元素測(cè)定波長(zhǎng)（A）檢測(cè)限（mg/L)元素測(cè)定波長(zhǎng)（A）檢測(cè)限（mg/L)Li670810-4Ca42273×10-3Na589010-4Sr46070.02K766510-3Ba49340.2Rb78000.05Mg38520.1Cs85211.0

（三）散射光譜分析法

散射光譜分析法主要測(cè)定光線通過(guò)溶液混懸顆粒后的光吸收或光散射程度的一類(lèi)定量方法。測(cè)定過(guò)程與比色法類(lèi)同，常用法為比濁法。但顆粒的大小和形狀及懸液的穩(wěn)定性對(duì)比濁結(jié)果有較大的影響，因此不能完全按比色法的規(guī)律進(jìn)行測(cè)定，否則就會(huì)引起誤差。

1、儀器和測(cè)定方法　由于測(cè)定儀器和方法的不同，比濁法又可分為散射測(cè)渾法（turbidimetry)和濁度測(cè)定法（nephelometry)二類(lèi)。前者利用一般的光電比色計(jì)和分光光度計(jì)，其原理是利用光線通過(guò)混懸溶液時(shí)，由于顆粒的散射使通過(guò)的光線減弱，根據(jù)光線減弱的程度測(cè)定溶液中顆粒的濃度，所以，實(shí)際上可將散射測(cè)渾法看成是比色分析的一種特殊情況。后者則是直接測(cè)定混懸溶液中顆粒散射光的強(qiáng)度，由于一般光電比色計(jì)中光源和光電管在一直線上，無(wú)法測(cè)定散射光線的強(qiáng)度，需要特殊的濁度計(jì)，如激光比濁儀。測(cè)定方法可采用速率法或終點(diǎn)法進(jìn)行。

速率散射比濁法是一種動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法，1977年由Seternbery首先用于免疫測(cè)定，在一定條件下，抗原和相應(yīng)的抗體很快結(jié)合成抗原抗體免疫復(fù)合物顆粒，速率比濁法就是在一定時(shí)間內(nèi)抗原抗體結(jié)合過(guò)程中，測(cè)定二者結(jié)合的最大反應(yīng)速度，即反應(yīng)達(dá)頂峰峰值。終點(diǎn)散射比濁法用于免疫測(cè)定時(shí)，在一定時(shí)間內(nèi)，通常是抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡，復(fù)合物的濁度不再受時(shí)間的影響，但必須在聚合形成絮狀沉淀之前進(jìn)行濁度測(cè)定。

2、影響比濁法測(cè)定的因素比濁法的突出問(wèn)題是顆粒的大小對(duì)濁度和濁度曲線有較大的影響。因此，在比濁法中必須力求作到：①混懸液中微粒的分散度也就是顆粒的大小應(yīng)盡可能相同，并易重復(fù)。標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管中顆粒大小應(yīng)力求一致。②混懸液在一定時(shí)間內(nèi)，至少10分鐘內(nèi)應(yīng)維持穩(wěn)定，也就是顆粒應(yīng)該不易相互聚集，變粗變大。為此，關(guān)鍵在于制備混懸液必須嚴(yán)格控制條件，一般應(yīng)注意；①沉淀劑或抗體的濃度，一般情況下濁度隨其濃度的增高而增大。②混勻方法和速度，一般而言，緩慢加入試劑，逐滴加入，不斷搖勻，易產(chǎn)生粗顆粒沉淀；而迅速加入，迅速搖勻，易產(chǎn)生膠態(tài)溶液。③溫度，溫度升高可加快分子間的碰撞，常使某些在室溫細(xì)小均勻的顆粒易變?yōu)榇执蟮男鯛畛恋?。④pH溶液，pH可影響沉淀的形成及顆粒的大小，如蛋白質(zhì)、酶類(lèi)，在其等電點(diǎn)pH值時(shí)最易形成顆粒并沉淀。⑤混懸液的穩(wěn)定性和測(cè)定時(shí)間，大多數(shù)混懸液隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)顆粒變粗而沉淀，吸光度下降，因此應(yīng)及時(shí)比濁。如出現(xiàn)沉淀太快，可以加入保護(hù)性膠體，如聚乙烯吡咯烷酮、表面活性劑等，但應(yīng)注意加入后可能會(huì)引起顆粒及光學(xué)性質(zhì)的變化。⑥其它電解質(zhì)和非電解質(zhì)存在的干擾。由此可見(jiàn)，比濁法易受外界各種因素的影響，因此在建立一種比濁測(cè)定方法時(shí)，必須認(rèn)真探索其反應(yīng)規(guī)律，力求控制各種影響因素以克服比濁法重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差的缺點(diǎn)。

3、比濁法的應(yīng)用目前在臨床生化檢驗(yàn)中使用最多的比濁法是免疫比濁法，如免疫球蛋白、載脂蛋白和補(bǔ)體等項(xiàng)目均已大部分用免疫比濁法進(jìn)行快速定量。

早在1838年Libby等人把比濁法測(cè)定就應(yīng)用到抗原抗體反應(yīng)上。所謂免疫比濁法是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合形成復(fù)合物，通過(guò)測(cè)定復(fù)合物形成量的多少，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定量的方法。在介質(zhì)溶液中形成復(fù)合物需要一定的條件，包括：①要有特異性抗體。作為組織或體液中蛋白質(zhì)種類(lèi)相當(dāng)多，若要快速特異測(cè)定，就需要有單價(jià)特異抗體，也就是說(shuō)，某一種蛋白有其特異抗體才能與該抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再定量。若抗體不純或混有另一種或兩種少量抗體，這種免疫復(fù)合物就不是單一復(fù)合物而是大雜燴，結(jié)果偏高。②抗原抗體的比例要適當(dāng)。因免疫復(fù)合物的形成有三個(gè)階段，第一階段是初步形成抗原抗體二元復(fù)合物；第二階段是復(fù)合物交聯(lián)成大的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)；第三階段是復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀。只有在抗原與抗體等價(jià)時(shí)即無(wú)過(guò)?？贵w，此時(shí)，復(fù)合物的結(jié)合和解離處在平衡狀態(tài)，其混濁程度達(dá)高峰，在抗體過(guò)量時(shí)，隨抗原量的增加而復(fù)合物的形成也增加，成正比關(guān)系，其測(cè)定只能在以應(yīng)曲線的左側(cè)進(jìn)行。同時(shí)，抗原也不能過(guò)量，因?yàn)榭乖^(guò)量，則復(fù)合物減少，光散射或光吸收就減少，檢測(cè)結(jié)果偏低。③溶液介質(zhì)適宜，一般要求溶液中有非離子性親水多聚體促進(jìn)免疫復(fù)合的形成，如聚乙二醇6000等，溶液pH以6.5～8.0之間為宜，離子強(qiáng)度大比小易形成復(fù)合物，對(duì)離子的種類(lèi)也有一定的要求。

在免疫比濁過(guò)程中，由于抗原與抗體結(jié)合有三個(gè)階段，從而導(dǎo)致吸光度與濃度之間不呈線性關(guān)系，一般是三次方程曲線關(guān)系。如果要將抗原與抗體兩個(gè)變量之間的變動(dòng)特征恰當(dāng)?shù)胤从吵鰜?lái)，需要經(jīng)三次方程擬合成近似直線化的曲線方程，再進(jìn)行運(yùn)算。方法可采用終點(diǎn)法和速率法，用五個(gè)不同濃度進(jìn)行定標(biāo)，經(jīng)三次曲線方程求出一條能反映真實(shí)情況的濃度與吸光度的關(guān)系曲線方程。作為定量的工作曲線。