《基因診斷與性傳播疾病》 三、基因診斷技術(shù)檢測(cè)梅毒螺旋體

梅毒螺旋體不能進(jìn)行體外培養(yǎng)。檢測(cè)臨床標(biāo)本中梅毒螺旋體最敏感、可靠的方法是兔感染試驗(yàn)（RIT），RIT能證實(shí)活的梅毒螺旋體存在，是檢測(cè)梅毒螺旋體常用的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而用RIT對(duì)新生兒或成人梅毒進(jìn)行常規(guī)診斷不切合實(shí)際。梅毒的血清學(xué)診斷對(duì)確定感染及治療很有意義，但對(duì)早期梅毒診斷不敏感，對(duì)先天性及神經(jīng)性梅毒的診斷不夠特異。血清學(xué)試驗(yàn)用作先天性梅毒的輔助診斷，其首要問(wèn)題是將無(wú)癥狀感染嬰兒從非感染嬰兒區(qū)別開來(lái)，這些嬰兒的母親梅毒血清試驗(yàn)陽(yáng)性，困難在于不能將母親體液免疫反應(yīng)同嬰兒的抗體反應(yīng)相區(qū)別，因?yàn)槟赣H的IgG可傳遞給胎兒。另外由于IgG終身存在，所以很難評(píng)價(jià)治療結(jié)果。血清學(xué)診斷常常又存在著假陽(yáng)性。

PCR檢測(cè)梅毒螺旋體DNA，特異性很強(qiáng)，敏感性很高，是目前診斷梅毒螺旋體的先進(jìn)方法。

（一）PCR引物的設(shè)計(jì)部位與序列：

目前有四套擴(kuò)增梅毒螺旋體DNA的系統(tǒng)：擴(kuò)增47KDa膜抗原基因（tpp47基因），擴(kuò)增39KDa堿性膜蛋白基因（bmp基因），擴(kuò)增TpF1蛋白基因（tpf-1）或TyF1蛋白基因（tyf-1）和擴(kuò)增tmpA基因。

三種擴(kuò)增系統(tǒng)的引物序列：

47-1CACAATGCTCACTGAGGATAGT648-669

47-2ACGCACAGAACCGAATTCCTTG1284-1035

Tpp47-3　TTGTGGTAGACACGGTGGGTAC713-734

47-4TGATCGCTGACAAGCTTAGGCT　 1187-1208

TP3　CAGGTAACGGATGCTGAGT　256-275

TP4　CGTGGCAGTAACCGCAGTCT 762-741

bmpTP5（探針） GACCTGAGGACTCTCAAATC 500-519

TP7　CTCAGCACTGCTGAGCGTAG 172-191

TP8　AACGCCTCCATCGTCACACC　788-769

F1　 CTCTTCAAGGAGCTCAT222-206

Tpf-1F2　 AGACAGTGGTTATGCTc 　 77-61

或tyf-1F3(探針)ATTGCGCCAGCATGTAG　 114-130

F4（探針）ATTGCGCCGGCATGTAG　 114-130

（二）操作方法

1．采集標(biāo)本，根據(jù)病人的情況可采取局部分泌物，抽取淋巴結(jié)液，羊水，血清，腦脊液。用適量的蒸餾水稀釋，保存于4℃冰箱。

2．標(biāo)本處理：目的是為了暴露梅毒螺旋體的DNA，消除標(biāo)本對(duì)PCR的抑制物。采用下列處理方法。

①煮沸法：取10或20μl血清或CSF放入0.5ml微量離心管中，水浴煮10min后在冰浴中冷卻，13000g離心10s，上清用作PCR分析。

②低速離心法：將100μl羊水，血清或腦脊液加入到900μl無(wú)菌磷酸緩沖液中，10000g室溫離心10min，上清轉(zhuǎn)入另外的微量離心管中，20000g4℃離心1h，棄上清，沉淀懸浮于50μl 無(wú)菌水中，直接煮沸10min，冰浴冷卻，取40μl上清作PCR。

③堿裂解法：取收集標(biāo)本100μl加于含1mol/lNaCl,1mol/L NaOH和0.1%SDS的溶液中煮沸1.5min,用400μl（0.5mol/L）Tris-HCl(pH8.0)中和。用相同體積的苯酚抽提，再以100μl 0.15mol/L NaCl抽提苯酚。整個(gè)600μl的溶液用相同體積的氯仿：異戊醇（24：1）抽提，然后用相同體積的異丙醇沉淀（-20℃過(guò)液）。13000g4℃離心15min，輕輕倒出上清，涼干。沿淀懸浮于51μl無(wú)菌水中，取20μl作PCR模板。

（三）PCR擴(kuò)增

1．?dāng)U增47KDa膜抗原基因:100ml反應(yīng)物含：10mmol/l TrisHCl(pH8.3),50mmol/L KCl，3mmol/LMgCl2,100μg/ml明膠，0.5μg引物(47-1和47-2),75mmol/LdNTPs,2.5u TaqDNA聚合酶。取不同量各種制備的DNA作模板,反應(yīng)過(guò)程:94℃15s，60℃1min,72℃1min,循環(huán)40次,末次循環(huán)增加72℃10min延伸時(shí)間,取10ml反應(yīng)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。點(diǎn)雜交分析產(chǎn)物：取10mlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入10ml0.5mol/LNaOH-1.5mol/NaCl溶液中變性10min,用380μ11.5mol/l NaCl-1mmol/L Tris(pH7.2)中和,然后用Minifold I點(diǎn)膜,80℃真空處理膜2h,用496bp探針65℃雜交過(guò)夜。探針為引物47-3和47-4的PCR產(chǎn)物,用隨機(jī)引物法標(biāo)記.

2．?dāng)U增39KDa堿性膜蛋白基因:25μ1反應(yīng)體系含:1×RT緩沖液,50mmol/lTris-HCl(pH8.5),50mmol/LNaCl,4mmol/LMgCl2,2mmol/L DTT(二硫基蘇糖醇),200μmol/l dNTP,100μmol/L引物(TP7和TP8)，0.01%牛血清白蛋白(無(wú)DNase和RNase),1UTaqDNA聚合酶,5μ1樣品,可加入0.05mmol/L四甲胺化氯增強(qiáng)PCR。

PCR1:先用引物TP7和TP8擴(kuò)增出617bp片段,反應(yīng)過(guò)程:94℃3min后進(jìn)入循環(huán)過(guò)程:94℃1min,65℃1min,72℃1min,循環(huán)數(shù)為30或35,每一循環(huán)中72℃延伸遞增5s,最后一次延伸時(shí)間延長(zhǎng)到6min.

PCR2:再用巢居引物TP3和TP4擴(kuò)增出500bp片段,PCR1產(chǎn)物用蒸餾水稀釋10倍,取5μ1用作第二次擴(kuò)增.PCR2中MgCl2和引物濃度分別為5mmol/L和20μmol/L引物(TP3和TP4),其它條件與PCR1相同。

PCR產(chǎn)物分析。①取10μ1反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳；②Southern印跡后,用寡核苷酸探針TP5(以32P作末端標(biāo)記)雜交。

3．?dāng)U增TpF1蛋白基因TyF1蛋白基因:100μ1反應(yīng)物含:50mmol/l KCl,10mmol/LTris-HCl(pH8.4),2.5mmol/L MgCl2,0.2mg/ml明膠,1μmol/ldNTP,2mmol/L引物(F1和F2),2.5UTaqDNA聚合酶,10μ1經(jīng)處理的兔睪丸梅毒螺旋體懸液,反應(yīng)過(guò)程:94℃1min,55℃ 1.5min,72℃ 2.5min,循環(huán)40次，取10μ1PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳,Southern印跡后,用tpf-1特異的探針F3和tyf-1特異物的探針F4分別雜交。

為使擴(kuò)增效率達(dá)到最大，反應(yīng)參數(shù)應(yīng)選擇最佳數(shù)值。使用大片段雙股DNA探針檢測(cè)PCR產(chǎn)物，而不用合成的寡核苷酸探針,因?yàn)檫@樣可通過(guò)標(biāo)記得到較高、特異的放射活性。另外，大片段探針能最大減少野生株tpp47可變序列的假陰性結(jié)果及由于Taq DNA聚合酶的錯(cuò)誤導(dǎo)致堿基替代的假陰性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)證實(shí)：PCR的敏感性確能達(dá)到檢測(cè)單一tpp47拷貝的水平。

由于臨床標(biāo)本可能含有大量人細(xì)胞和微生物，建立對(duì)梅毒螺旋體高度特異的PCR方法是很重要的。盡管大量數(shù)椐支持47Da膜抗原基因及其相應(yīng)基因具梅毒螺旋體特異性，還應(yīng)深入研究該方法的特異性。在EB染色的瓊脂糖凝膠偶而可見非特異的PCR產(chǎn)物，（如擴(kuò)增淋病奈氏球菌）時(shí)就需要用tpp47特異的探針雜交來(lái)增加特異性及敏感性。僅從梅毒螺旋體梅毒亞種和雅司亞種染色體DNA獲得了特異的PCR產(chǎn)物，表明了病原性螺旋體非常相近的親緣關(guān)系及47Da免疫蛋白高度保守的抗原性。擴(kuò)增tpp47不能如常規(guī)法那樣能區(qū)分梅毒螺旋體和伯氏疏螺旋體，在用血清學(xué)試驗(yàn)診斷梅毒和萊姆疾病時(shí)，這兩種螺旋體有交叉反應(yīng)。

梅毒螺旋體梅毒亞種tpf-1基因在123位置為A，雅司亞種tpf-1基因在123位置為G，Noordhoek用tpf-1或tpf-1特異的寡核苷酸探針（兩種探針僅一個(gè)核苷酸不同）檢測(cè)不同菌株tpf-1或tpf-1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明：不能根據(jù)tpf-1或tyf-1基因123位置核苷酸的不同來(lái)區(qū)別梅毒亞種。這些菌種從梅毒患者分離，一些已用兔傳代多次，通過(guò)對(duì)新鮮臨床標(biāo)本中梅毒螺旋體DNA的分析比較，以上結(jié)果可能是由于梅毒螺旋體在傳代中點(diǎn)突變所致。