《基因診斷與性傳播疾病》 六、PCR實(shí)驗(yàn)中常見問題對(duì)策

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有成功或失敗，實(shí)驗(yàn)的失敗可能是應(yīng)該出結(jié)果而沒有出，我們把它稱作假陰性，不該出結(jié)果而出了結(jié)果我們把它稱為假陽(yáng)性。PCR實(shí)驗(yàn)中最常見的問題就是假陰性和假陽(yáng)性問題。

（一）假陰性：出現(xiàn)假陰性結(jié)果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠。所以在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性失敗時(shí)，首先在原來擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環(huán)，一般都會(huì)獲得成功。如果沒有成功應(yīng)檢查PCR擴(kuò)增儀的溫度是否準(zhǔn)確，采集標(biāo)本是否有問題。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用Taq DNA聚合酶時(shí)，要注意用活力高質(zhì)量好的酶。同時(shí)在提取PCR模板時(shí)，應(yīng)特別注意防止污染抑制酶活性物質(zhì)（如酚、氯仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對(duì)模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機(jī)試劑的污染。PCR擴(kuò)增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補(bǔ)，尤其是要絕對(duì)保證引物的3′端與靶基因的互補(bǔ)。對(duì)變異較大的擴(kuò)增對(duì)象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進(jìn)行PCR操作時(shí)應(yīng)注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應(yīng)的各溫度點(diǎn)的設(shè)置要合理。

（二）假陽(yáng)性：PCR結(jié)果的假陽(yáng)性是對(duì)被檢測(cè)標(biāo)本而言，而反應(yīng)系統(tǒng)中所擴(kuò)增的產(chǎn)物是真實(shí)的。因?yàn)镻CR技術(shù)高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會(huì)造成大量擴(kuò)增，而造成結(jié)果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽(yáng)性的主要根源。PCR的污染主要是標(biāo)本間的交叉污染和擴(kuò)增子的污染。出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽(yáng)性，PCR操作時(shí)要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性吸頭。