《動脈粥樣硬化》 一、膠原的提取

動脈血管壁膠原提取的基本方法是，首先除去凝血等其他雜質(zhì)，由于膠原為桿狀三螺旋結(jié)構(gòu)，能耐受胃蛋白酶的作用，但是兩端球蛋白結(jié)構(gòu)能被胃蛋白酶水解。膠原纖維內(nèi)分子間的共價交聯(lián)是由分子末端賴氨酸或羥賴氨酸形成，用胃蛋白酶切斷末端交聯(lián)結(jié)構(gòu)，使膠原分子的巨形結(jié)構(gòu)被破壞，從完整分子可提出各種類型的膠原。

（一）膠原的初步分離

1．小心取出動脈血管，用0.05mol/L BPS pH7.8洗凈凝血塊，3kr/min離心10min。

2．冷丙酮酸浸泡24h除去脂肪，蒸餾水洗滌3次。

3．將組織破碎，加三倍體積組織勻漿處理液（0.5mol/L乙酸，pH2.5，1%胃蛋白酶）于4℃48h,16kr/min離心45min，同樣方法重復(fù)3次。

4．向留取的上清液中緩緩加入NaCl，最終達(dá)到4mol/L濃度，攪拌12～24h，15kr/min離心45min，棄上清。

5．進一步分離各種膠原可用分段鹽析和柱層析法進行操作。

（二）膠原的分段鹽析

1．取初級提取物加0.1mmol/L乙酸，加NaCl至0.7mmol/L，15kr/min離心20min。沉淀提?、瘛ⅱ?、Ⅳ型膠原，上清提?、?、Ⅴ型膠原。

2．沉淀，加0.14mol/L PBS pH7.6,37℃保濕16h，10kr/min離心20min，上清液加NaCl至4mol/L，離心，沉淀物為Ⅳ型膠原。

3．1mol/L NaCl溶解沉淀，加3倍體積Tris-HCl pH7.4，10kr/min離心20min，沉淀為Ⅲ型膠原。

4．上清加NaCl至2.5mol/L,10kr/min離心20min，沉淀為Ⅰ膠原。

5．取1.操作的上清加NaCl至1.2mol/L,15kr/min離心20min。

6．沉淀溶于4倍體積1.0mol/L NaCl、0.05mol/l Tris-HCl pH7.4，加NaCl至4mol/L 10kr/min離心20min。

7．上清加NaCl至4mol/L，調(diào)pH到3.5,離心得沉淀再加5倍體積0.2mol/l NaCl、1mol/L脲、0.01mol/L Tris-HCl pH7.4的DEAE液懸浮16h，小心取上清加NaCl至4mol/L，10kr/min離心10min，沉淀為Ⅳ型膠原。

8．將6.沉淀部分加0.2mol/LNaCl,10.05mol/l Tirs-HCl pH7.4的DEAE懸浮16h，上清加NaCl至4mol/l,10kr/min離心10min，沉淀為Ⅴ型膠原。

（三）將初步提取的膠原加到DEAE纖維柱上，用0.2mmol/l NaCl、0.05mol/L Tris-HCl pH7.5的溶液洗脫，230nm波長檢測洗脫物。因為膠原在pH7.5時均帶正電荷，不與DEAE柱結(jié)合，所以被柱結(jié)合的則為非膠原蛋白。