《動脈粥樣硬化》 一、血清脂蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳

（一）原理

以聚丙烯酰胺為支持介質(zhì)，血清脂質(zhì)用染料預(yù)染，使脂蛋白著色，經(jīng)電泳后，一般可分出三條區(qū)帶，即β-、前β-、α-脂蛋白。并可用光密度掃描儀檢測其相對百分?jǐn)?shù)，乘以總脂量，可求出三種脂蛋白的含量。

（二）試劑與儀器

1．試劑

（1）分離膠緩沖液：三羥甲基氨基甲烷（Tris）18.3g,lmol/L鹽酸24ml，加水至100ml(pH8.9)。

（2）丙烯酰胺Ⅰ液：丙烯酰胺（Acr）15g，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.4g，混勻。

（3）0.35%過硫酸銨（AP）

（4）四甲基乙二胺（TEMED）

（5）丙烯酰胺Ⅱ液：Acr10g、Bis2.5g、加水至100ml，混勻。

（6）濃縮膠緩沖液：Tris 6g、1mol/L HCl。

（7）0.002%核黃素，48ml，加水至100ml，pH6.7。

（8）電極緩沖液：甘氨酸2.88g、Tris0.6g、加水至1000ml，pH8.3。

（9）1%蘇丹黑B染色液：蘇丹黑B200mg，丙二醇20ml，水浴加溫至溶，離心，去除沉渣，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（10）40%蔗糖水溶液。

2．儀器

電泳儀、光密度掃描儀

（三）操作

1．制膠

（1）先準(zhǔn)備清潔的0.5×7.5cm玻璃管，封口底。

（2）配制5%濃度凝膠：取丙烯酰胺Ⅰ液5ml，分離膠緩沖液5ml及Ap液10ml混合，再加TEMED，20μl，混均，用吸管注入每支玻璃管內(nèi)使膠柱長約4cm，上層用蒸餾水沿管壁仔細(xì)加水到凝膠表面，千萬別沖散凝膠界面，使凝膠與空氣隔絕。靜置20～40min，等凝膠凝固后，除去上層水，再加上濃縮膠。

（3）濃縮膠制備：取丙烯酰胺Ⅱ液1.0ml、濃縮膠緩沖液0.5ml、核黃素液0.5ml和水2ml混勻，加TEMED20μl混勻，迅速加入到分離膠上層約1cm高度，沿管壁仔細(xì)加蒸餾水覆蓋，千萬別沖散凝膠界面。置日光燈處聚合30min，也可在強(qiáng)光下聚合，聚合好的濃縮膠呈淡乳白色。凝膠可置4℃冰箱備用。

2．血清預(yù)染與加樣

在0.25ml血清中加入1%蘇丹黑B染色液0.025ml，搖勻，于37℃水溶保溫45min。離心除去沉渣，取預(yù)染血清30μl，加在聚合好的傾去水層的濃縮膠表面，再加一滴40%蔗糖液，混勻，然后小心地在上面加滿電極緩沖液，再裝在電泳槽上。

3．電泳

將電極液加入上下電泳槽內(nèi)，靠樣品端的上槽接負(fù)極，下槽為正極，接通電源，調(diào)節(jié)電流為2-5mA/管，30～40min后，關(guān)閉電源。

4．剝膠

從電泳槽上取下凝膠管，用帶長針頭的注射器吸水注入凝膠與玻管內(nèi)壁之間，使凝膠與玻管內(nèi)壁分離，再用吸耳球推出凝膠。根據(jù)不同型號的光密掃描儀，凝膠掃描或者將裝有凝膠的玻管直接掃描定量。

電泳后凝膠一般出現(xiàn)三條區(qū)帶，從正極到負(fù)極依次為α-脂蛋白，β-脂蛋白和前β-脂蛋白，前β-脂蛋白處于濃縮膠和分離膠之間。

5．定量

漿凝膠或連同玻管一道置于光密度計(jì)掃描儀上進(jìn)行掃描，計(jì)算每個峰的面積占各峰之和和總面積之比，即為每種脂蛋白組份的百分比。