《中國(guó)生物制品規(guī)程》 莢膜多糖抗原分子大小測(cè)定（瓊聚糖4B柱層析法）

1　試劑

1.1　瓊聚糖4B凝膠。

1.20.2mol　/L　氯化鈉溶液，pH7.0洗脫液。

1.3　藍(lán)色葡聚糖2000（2～4mg）加維生素B12（0.2mg），加蒸餾水1ml溶解。

2　儀器

2.1　層析柱（1.5～1.6×100cm）。

2.2　206nm波長(zhǎng)紫外監(jiān)測(cè)儀。

2.3　部分收集器及試管。

2.4　凝膠和洗脫液儲(chǔ)瓶，適宜的控制裝置和記錄器。

3　操作

3.1　瓊聚糖4B凝膠的漂洗

取瓊聚糖4B凝膠約300ml，加0.2mol　/L　氯化鈉溶液500ml，充分?jǐn)嚢?，靜置1～2小時(shí)，傾去上層液體和懸浮于其中的細(xì)小顆粒，重復(fù)上述操作數(shù)次后至上層液體無(wú)細(xì)小顆粒，置真空罐內(nèi)，抽去凝膠中的空氣。

3.2　裝柱

將洗好的瓊聚糖4B凝膠慢慢注入柱中，避免夾雜氣泡，裝至約90cm，調(diào)整流速為10～12ml　/小時(shí)，流洗2天。

3.3　標(biāo)定

空流體積（Vo）及柱床總體積（Vi）

取藍(lán)色葡聚糖及維生素B12溶液1ml，加于已平衡的柱上，以0.2mol　/L　氯化鈉溶液流洗，用部分收集器收集各組分，流速為10～12ml　/小時(shí)，每管2～4ml，同時(shí)于206nm波長(zhǎng)下自動(dòng)監(jiān)測(cè)，記錄流洗液圖譜。第一峰為藍(lán)色葡聚糖峰，計(jì)算由加樣起至第一峰峰頂?shù)牧飨匆后w積，即為Vo。第二峰為維生素B12峰，計(jì)算由加樣起至第二峰峰頂?shù)牧飨匆后w積，即為Vi。

3.4　多糖抗原Kd值的測(cè)定

3.4.1　取約1ml樣品（含多糖抗原3～5mg，凍干樣品可用1.2項(xiàng)溶液溶解）。加于已標(biāo)定的瓊聚糖4B膠柱上，用0.2mol　/L　氯化鈉溶液流洗，流洗液用量為柱床總體積的1.5倍，每管收集2～4ml，同時(shí)于206nm波長(zhǎng)下自動(dòng)監(jiān)測(cè)，記錄流洗液圖譜，由加樣起至多糖峰峰頂流洗體積為Ve，計(jì)算分配系數(shù)（Kd）。

Kd=Ve―Vo/Vi―Vo

3.4.2Kd≤0.5多糖抗原回收率的計(jì)算

用求積儀分別計(jì)算Kd值0.5以前組分峰的面積除以所有組分峰的面積，即得Kd≤0.5多糖抗原回收率。

Kd≤0.5多糖回收率（%）=Kd0.5以前組分峰的面積/所有組分峰的總面積×100

注意：過(guò)柱操作在10～20℃下進(jìn)行。