《中國(guó)生物制品規(guī)程》 附錄5　肉毒抗毒素效價(jià)測(cè)定法（小白鼠試驗(yàn)法）

1　試劑

1.1標(biāo)準(zhǔn)抗毒素

由中國(guó)藥品生物制品檢定所按期分發(fā)，所標(biāo)單位應(yīng)與國(guó)際單位等值。標(biāo)準(zhǔn)抗毒素應(yīng)保存于2～8℃。

1.2毒素

由中國(guó)藥品生物制品檢定所分發(fā)。亦可自備，但其制法（包括菌種、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及干燥方法等）應(yīng)與檢定所分發(fā)者相同。試驗(yàn)用的毒素須以中國(guó)藥品生物制品檢定所分發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)抗毒素準(zhǔn)確標(biāo)定其試驗(yàn)量（見一覽表），并每3個(gè)月復(fù)檢1次。使用干燥毒素時(shí)，須以精確的分析天平稱取，每次稱量不得少于10mg，溶解后應(yīng)一次用完。余存之干燥毒素應(yīng)封存于裝有干燥劑之真空器皿中。亦可用干燥毒素制成液體甘油毒素，即干燥毒素生理鹽水溶解液與中性甘油（經(jīng)116℃10分鐘高壓蒸汽滅菌者）等量混合，每ml至少含20個(gè)試驗(yàn)量。毒素應(yīng)保存于2～8℃暗處。

1.3稀釋液

1.2%明膠磷酸鹽緩沖鹽水，滅菌后pH值應(yīng)為6.2～6.8，配方為：

磷酸二氫鉀　0.7g

磷酸氫二鈉（12結(jié)晶水）2.4g

氯化鈉　6.8g

加蒸餾水至1000ml，加明膠2.0g，溶解后過濾。

2　用具

吸管、容量瓶、注射器應(yīng)經(jīng)標(biāo)化（用雙蒸餾水稱量法或其他準(zhǔn)確方法）。吸管、試管、容量瓶應(yīng)潔凈干燥，注射器及針頭應(yīng)煮沸消毒。

3　試驗(yàn)動(dòng)物

用體重14～16g健康小白鼠。

4　試驗(yàn)方法

4.1標(biāo)準(zhǔn)抗毒素之稀釋

用稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)抗毒素，使每ml所含IU如一覽表所示。原液的一次吸取量不應(yīng)少于0.5ml。

4.2毒素之稀釋

用稀釋液稀釋毒素，使每ml含5個(gè)毒素試驗(yàn)量，如一覽表所示。

4.3待檢抗毒素之稀釋

用稀釋液將待檢抗毒素稀釋成數(shù)個(gè)稀釋度，使每ml約含一覽表所示單位或其上下。稀釋度之間隔約為5%～10%。

4.4混合

4.4.1標(biāo)準(zhǔn)抗毒素對(duì)照組

吸取已稀釋之標(biāo)準(zhǔn)抗毒素0.9、1.0、1.1ml分別裝入小試管中，再依次分別補(bǔ)加稀釋液0.6、0.5、0.4ml（可在抗毒素之前加入）。

4.4.2待檢抗毒素試驗(yàn)組

吸取不同稀釋度之待檢抗毒素各1.0ml分別裝入小試管中，每管補(bǔ)加稀釋液0.5ml（可在抗毒素之前加入）。

以上各管分別加入稀釋毒素1.0ml，混合均勻，加塞，37℃結(jié)合45分鐘，立即注射。

混合時(shí)，吸取標(biāo)準(zhǔn)抗毒素、待檢抗毒素及毒素的吸管不得混用（若不得不用同1支吸管吸取待檢抗毒素，則應(yīng)由高稀釋度向低稀釋度依次吸取。每更換1稀釋度之前須將吸管內(nèi)的剩余液吹凈，將吸管外部所沾殘液拭凈，吸取下1稀釋度液到前次吸取的最高處，廢棄之，再于該管內(nèi)連續(xù)吸吹3次。但1支吸管只得用于1份樣品）。

4.5注射

按一覽表所示劑量與途徑，每1稀釋度液注射小白鼠4只。

4.6觀察

每天上、下午各觀察試驗(yàn)動(dòng)物1次，并記錄發(fā)病及死亡情況，連續(xù)4天。

4.7結(jié)果判定

4.7.1以對(duì)照組動(dòng)物50%死亡終點(diǎn)比較待檢抗毒素試驗(yàn)組動(dòng)物的50%保護(hù)終點(diǎn)推算待檢抗毒素的效價(jià)。

4.7.2有下列情況之一者予以重試：

（1）對(duì)照組動(dòng)物無死亡或死亡，或死亡極不規(guī)律而無法計(jì)算50%死亡終點(diǎn)。

（2）待檢組動(dòng)物無死亡或全死亡，或死亡極不規(guī)律而無法計(jì)算50%保護(hù)終點(diǎn)。

（3）在一稀釋度的動(dòng)物中有2只以上屬非特異死亡。

肉毒抗毒素效價(jià)測(cè)定法一覽表

抗毒素型別毒素試驗(yàn)量稀釋混合注射抗毒素(IU/ml)毒素(試驗(yàn)量/ml)抗毒素(ml)毒素(ml)稀釋液(ml)劑量(ml)抗毒素(IU)毒素(試驗(yàn)量)動(dòng)物只數(shù)途徑AL+/51.051.01.00.50.51/514靜脈BL+/100.551.01.00.50.51/5014皮下EL+/500.151.01.00.50.51/5014靜脈