《中國(guó)生物制品規(guī)程》 附錄　WHO推薦的白喉類毒素效價(jià)測(cè)定方法

可選用以下兩種方法之一種進(jìn)行。

（一）Vero細(xì)胞測(cè)定抗體法

1　免疫與采血

用生理鹽水將吸附白喉類毒素標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣品以2倍稀釋法稀釋成3～5個(gè)適當(dāng)稀釋度，每一稀釋度樣品免疫體重10～14g小白鼠8只，皮下注射0.5ml，免疫5周后，每個(gè)小白鼠采血，分離血清，56℃30分鐘滅活，放-20℃保存。

2　毒素試驗(yàn)量測(cè)定

Vero細(xì)胞測(cè)定白喉抗體試驗(yàn)時(shí)毒素試驗(yàn)量采用Lcd/10000。

在96孔培養(yǎng)板中用RPMI1640（或199）培養(yǎng)液將毒素做2倍系列稀釋，每孔50μl，然后向各孔中加入50μl標(biāo)準(zhǔn)白喉抗毒素（0.0001IU），用膠帶密封，在室溫放置1小時(shí)后，加入50μlVero細(xì)胞懸液（見(jiàn)3項(xiàng)）密封，放37℃CO2孵箱培養(yǎng)6～7天后，觀察結(jié)果，使細(xì)胞死亡的最大毒素稀釋度孔（紅色）就是Lcd/10000。

Lcd/10000的毒素量約相當(dāng)于1×10-4Lf的毒素適用于本試驗(yàn)。

3　Vero細(xì)胞

RPMI1640（或199）培養(yǎng)液（加青霉素100IU/ml，鏈霉素100μg/ml，胎牛血清10%）。Vero細(xì)胞培養(yǎng)于150cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)成占瓶底80%～100%單層時(shí)，棄去上層培養(yǎng)液，加10ml0.25%胰酶，放37℃數(shù)分鐘，棄去胰酶，加入10ml培養(yǎng)液，打勻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)（1瓶150cm2培養(yǎng)瓶大約可得10～40×106細(xì)胞）。用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×105細(xì)胞/ml。

4　陽(yáng)性對(duì)照小白鼠血清

用吸附白喉類毒素免疫1批小白鼠，免疫5周后采血，分離血清，分裝小管，冷凍干燥，保存于-20℃。

5　抗體滴定

按下圖將培養(yǎng)板編號(hào)：

A1　A2　A3　A4　A5　A6　A7　A8　A9　A10　A11　A12

B1

C1

D1

E1

F1

G1

H1

（1）向每孔加入50μl培養(yǎng)液，但A11、A12和H11、H12孔不加，而G11、G12加100μl培養(yǎng)液。

（2）取8份待檢血清，分別加入A1至H1孔各50μl，橫向進(jìn)行2倍系列稀釋，直至A10和H10孔。

（3）將標(biāo)準(zhǔn)白喉抗毒素稀釋至0.008IU/ml，加入A11、A12、B11和B12孔各50μl，從B11和B12孔開(kāi)始豎向做2倍稀釋至D11和D12孔。

（4）H11和H12孔加入陽(yáng)性小白鼠對(duì)照血清50μl。

（5）除G11和G12孔外，向其余各孔中加入毒素（Ldc/10000）50μl，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板，混勻，在培養(yǎng)板上貼上膠帶將板孔封閉，放室溫1小時(shí)。

（6）收集Vero細(xì)胞，進(jìn)行計(jì)數(shù)，并稀釋成2.5×細(xì)胞/ml的Vero細(xì)胞懸液。

（7）室溫放置1小時(shí)之培養(yǎng)板，去膠帶，立即加入50μlVero細(xì)胞懸液，再用膠帶封閉培養(yǎng)板，放37℃CO2孵箱培養(yǎng)6天。在24小時(shí)及48小時(shí)檢查膠帶封閉情況，如出現(xiàn)封閉不嚴(yán)應(yīng)更換。

（8）培養(yǎng)6天后取出培養(yǎng)板，根據(jù)培養(yǎng)液顏色變化記錄結(jié)果，黃色為（+），紅色為（-），羲色不明顯者則可用顯微鏡觀察，如單層細(xì)胞完整無(wú)損則為（+），否則記錄（-）。最終結(jié)果以打分表示，即變成黃色的最高稀釋度孔的2的指數(shù)，例如：變黃的最后一孔是1/256即28，則結(jié)果記為8。

6　試驗(yàn)要求

E11、E12、F11和F12孔代表毒素量和Vero細(xì)胞敏感度都出現(xiàn)（-），如果出現(xiàn)（+），則毒素量和細(xì)胞敏感度都很低，應(yīng)重試。

細(xì)胞孔G11、G12和陽(yáng)性對(duì)照孔H11、H12必須是（+），如出現(xiàn)（-），應(yīng)重視。

Lcd/10000毒素量的準(zhǔn)確性，根據(jù)以上計(jì)劃下列各孔中所加標(biāo)準(zhǔn)抗毒素為：

孔A11和A120.0004IU

B11和B120.0002IU

C11和C120.0001IU

D11和D120.00005IU

如毒素用量準(zhǔn)確（Lcd/10000），則A11、A12和B11、B12孔應(yīng)為（+），而C11、C12和D11、D12應(yīng)為（-），否則應(yīng)重試。

7　結(jié)果計(jì)算

用平行線分析法進(jìn)行結(jié)果計(jì)算

8　結(jié)果判定

待檢樣品的效價(jià)每劑量應(yīng)不少30IU。如95%可信限大于50%～200%，則95%可信限的低限效價(jià)應(yīng)大于30IU/1個(gè)人用劑量。

（二）豚鼠毒素攻擊法

1　免疫及攻擊

用生理鹽水將吸附白喉類毒素標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣品稀釋成等比間隔的3～5個(gè)稀釋度（中間的稀釋度必須在攻毒后能保護(hù)約半數(shù)動(dòng)物），每一稀釋度樣品免疫體重250～300g之豚鼠至少10只，另外5只豚鼠不注射作為對(duì)照。免疫后4周，每只免疫豚鼠攻擊白喉毒素100LD50，皮下注射1.0ml。對(duì)照組健康動(dòng)物注射100倍稀釋之上述毒素，每只皮下注射1.0ml。攻擊毒素后觀察5日，每日記錄結(jié)果。

2　試驗(yàn)成立應(yīng)具備的條件

（1）檢品的最低稀釋度能保護(hù)半數(shù)以上動(dòng)物。

（2）檢品的最高稀釋度保護(hù)半數(shù)以下動(dòng)物。

（3）對(duì)照組動(dòng)物應(yīng)部分死亡而不全部死亡。

（4）檢品和標(biāo)準(zhǔn)品的劑量反應(yīng)曲線在平行性及直線性上沒(méi)有太大的偏差。

3　結(jié)果計(jì)算及結(jié)果判定

見(jiàn)Vero細(xì)胞法7和8項(xiàng)。