《中國生物制品規(guī)程》 凍干流行性乙型腦炎活疫苗制造及檢定規(guī)程

本品系將流行性乙型腦炎（下稱乙腦）SA14-14-2減毒株病毒接種于原代地鼠腎單層細胞，經(jīng)培育后收獲病毒液，加保護劑凍干制成。用于預防乙腦。

1　毒種

1.1　毒種來源

乙腦SA14-14-2減毒株病毒。由中國藥品生物制品檢定所檢定與分發(fā)。

該毒株經(jīng)用乙腦敏感動物試驗證明其嗜神經(jīng)毒力減弱，經(jīng)檢查無外源因子存在，用乙腦特異性免疫血清做中和試驗證實為乙腦病毒，并經(jīng)免疫力試驗證明具有免疫原性，經(jīng)臨床觀察證明安全有效。

1.2　生產(chǎn)毒種批制備

毒種啟封后，在地鼠腎單層細胞上增殖傳遞，傳遞代數(shù)不得超過3代。從原始毒種算起，總代數(shù)不是超過10代。在傳代細胞病變明顯時收獲病毒液，經(jīng)檢定合格后為生產(chǎn)毒種批。

1.3　毒種檢定

1.3.1　無菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

1.3.2　支原體檢查

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

1.3.3　病毒滴定

抽樣品做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6三個稀釋度的病毒液，分別接種BHK21細胞，用蝕斑法進行滴定，病毒滴度≥7.2LogPFU/1.0ml為合格。凍干毒種批的滴度≥5.7LogPFU/1.0ml為合格。做病毒滴定同時應(yīng)用參考苗進行滴定，以判斷試驗結(jié)果是否成立。

1.3.4　純毒試驗

生產(chǎn)毒種批與非同源性乙腦高價免疫血清混合，置37℃90分鐘，接種地鼠腎單層細胞或BHK21細胞進行中和試驗，觀察5～7天判定結(jié)果。乙腦病毒完全被中和（無細胞病變或蝕斑出現(xiàn)）為合格，如仍有病變或蝕斑出現(xiàn)，應(yīng)按上述方法再行中和。

1.3.5　腦內(nèi)致病力試驗

生產(chǎn)毒種批原液接種體重12～14g小白鼠10只，每只腦內(nèi)注射0.03ml，接種后3天內(nèi)死亡者不計，觀察14天應(yīng)活存。3天后如有小白鼠發(fā)病，應(yīng)殺死取腦測定致病力，對小白鼠的腦內(nèi)毒力不應(yīng)超過3.0LogLD50/0.03ml，同時小白鼠皮下注射0.1ml10-1病鼠腦懸液進行皮下致病力試驗，觀察14天，應(yīng)健存。

1.3.6　皮下感染人腦試驗

生產(chǎn)毒種批原液接種體重10～12g小白鼠10只，每只皮下注射0.1ml，同時右側(cè)腦內(nèi)空刺，觀察14天，應(yīng)健存。

1.3.7　乳鼠傳代返祖試驗

生產(chǎn)毒種批原液接種3～5日齡乳鼠10只，每只腦內(nèi)注射0.02ml。將發(fā)病的乳鼠殺死3只，解剖取腦測其致病力，用體重12～14g小白鼠測定，腦內(nèi)毒力不應(yīng)超過3.0LogLD50/0.03ml，同時皮下注射10只小白鼠，每只0.1ml10-1乳鼠腦懸液，觀察14天，應(yīng)健存。

1.3.8　外源因子檢查

生產(chǎn)毒種批經(jīng)非同源性乙腦高價免疫血清中和后，進行細胞培養(yǎng)試驗。樣品分別接種人二倍體細胞、BHK21細胞、原代地鼠腎細胞，于33～35℃進行培育，同時做對照培育。培育7、14天細胞應(yīng)無病變，分別進行次代培育和血吸附試驗；次代培育7、14天時亦分別觀察細胞病變和進行血吸附試驗。結(jié)果均無細胞病變并血吸附試驗陰性為合格。

血吸附試驗方法：觀察到期的細胞，用0.2%～0.5%雞、豚鼠紅細胞混合液于4～8℃、20～25℃中依次進行血吸附檢查。所用紅細胞于2～8℃保存應(yīng)不超過7天。

1.3.9　細胞基質(zhì)外源因子檢查

制備生產(chǎn)用種子批的細胞留取5%～10%不種毒，更換相應(yīng)的維持液，置33～35℃培育。在培育7、14天時，鏡下觀察無細胞病變后分別做血吸附試驗（方法同1.3.8項）。細胞無病變并血吸附試驗陰性為合格。

1.4　生產(chǎn)毒種批保存

液體生產(chǎn)毒種批于-60℃保存不超過6個月可用于生產(chǎn)；凍干生產(chǎn)毒種批于-20℃以下保存2年內(nèi)可用于生產(chǎn)。

2　疫苗制造

2.1　細胞制備

2.1.1　地鼠

選用10～14日齡健康地鼠，解剖取腎。如發(fā)現(xiàn)腎臟異常或有乳糜狀腹水，應(yīng)廢棄。

2.1.2　疫苗生產(chǎn)過程中不得使用青毒素或其他β內(nèi)酰胺類抗生素。

2.1.3　細胞消化及培養(yǎng)

解剖取出腎臟后剪成碎塊，用適量的胰蛋白酶液消化，將分散后的細胞懸液種入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入生長液，置36～37℃培養(yǎng)。細胞生長成致密單層即可接種病毒。

2.1.4　外源因子檢查

每批細胞留取5%～10%不接種病毒，加入與生產(chǎn)相同維持液后置33～35℃培育14天。在培育7、14天時分別做血吸附試驗（方法同1.3.8項）。在觀察期內(nèi)細胞無病變并血吸附試驗陰性為合格。如細胞出現(xiàn)病變或血吸附試驗陽性，由該批細胞制備的病毒原液應(yīng)廢棄。

2.2　病毒接種和培育

挑選長成致密單層的細胞，用洗液充分洗滌后加適量維持液，病毒接種量為2.7～3.7LogPFU/1.0ml，置35～36℃培育。

2.3　原液

2.3.1　收獲病毒液

種毒后培育72小時以上，細胞出現(xiàn)明顯病變時收獲病毒液，澄清過濾后為原液。

2.3.2　原液檢定

2.3.2.1　無菌試驗

每瓶原液分別取樣做無菌試驗，樣品種入硫乙醇酸鹽、乙良馬丁和肝斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)8天判定結(jié)果。

2.3.2.2　支原體檢查

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

2.3.2.3　純毒試驗

每一消化批應(yīng)抽樣進行純毒試驗。方法同1.3.4項。

2.3.2.4　病毒滴定

方法同1.3.3項。滴度≥7.2LogPFU/1.0ml為合格。

2.4　疫苗半成品

2.4.1　疫苗混合

檢定合格的原液合并后，加適宜保護劑。每批疫苗量應(yīng)不超過15萬ml。

2.4.2　無菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行

2.4.3　分裝和凍干

疫苗應(yīng)在冰浴下進行分裝，采用適宜的凍干條件進行凍干。出柜后應(yīng)在15℃以下進行封口。

3　成品檢定

3.1　外觀檢查

凍干疫苗應(yīng)為淡黃色疏松體。如稀釋液后迅速溶解，溶解后應(yīng)為橘紅色透明液體，無異物。

3.2　殘余水分含量

凍干疫苗殘余水分應(yīng)≤3.5%。

3.3pH值

凍干疫苗用蒸餾水復溶后，pH值應(yīng)為7.2～8.0。

3.4　病毒滴定

方法同1.3.3項。病毒滴度≥5.7LogPFU/1.0ml為合格。

3.5　熱穩(wěn)定性試驗

凍干疫苗置37℃7天后進行滴定（方法同1.3.3項），滴度下降不應(yīng)超過1.0LogPFU/ml。

3.6　無菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

3.7　安全試驗

3.7.1　腦內(nèi)致病力試驗

方法及判定標準同1.3.5項。

3.7.2　皮下感染入腦試驗

方法及判定標準同1.3.6項。

3.7.3　乳鼠傳代返祖試驗。

方法及判定標準同1.3.7項。

3.8　毒性試驗

凍干疫苗每支加稀釋液2.5ml溶解復原后，用體重12～15g小白鼠4只，每只腹腔注射0.5ml。注射后密切觀察，30分鐘內(nèi)不應(yīng)有異常反應(yīng)，觀察3天應(yīng)健存。

3.9　殘余牛血清蛋白含量

凍干疫苗每支加稀釋液2.5ml溶解復原后，殘余牛血清蛋白含量≤50ng/ml為合格。

4　疫苗稀釋液

pH7.4～7.6滅菌磷酸鹽緩沖生理鹽水。每支安瓿2.5ml。

5　保存與效期

疫苗自凍干后病毒滴定合格之日起，在8℃以下保存效期為1年半，在-20℃保存效期為2年。