《中國生物制品規(guī)程》 短棒狀桿菌菌苗制造及檢定規(guī)程

本品系用具有免疫調(diào)節(jié)及抑瘤等活性的厭氧棒狀桿菌經(jīng)培養(yǎng)后制成懸液，加甲醛殺菌，以無菌緩沖生理鹽水稀釋而成。用于惡性腫瘤及其他疾病的免疫治療。

1　菌種

1.1　菌種來源

制造菌苗用的菌種采用厭氧短棒狀桿菌H75010或其他經(jīng)試驗(yàn)證明安全有效的菌株。生產(chǎn)用菌種和檢定用血清，由中國藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。

1.2　菌種檢定

1.2.1　培養(yǎng)特性

檢定菌種用碎肉半流體、肝硫乙醇酸鈉培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基。本菌應(yīng)為革蘭氏陽性短棒狀菌，有異染顆粒。

1.2.2　生化反應(yīng)

應(yīng)發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵棉子糖、麥芽糖、蔗糖，液化明膠，靛基質(zhì)、硝酸鹽反應(yīng)陽性。

1.2.3　血清學(xué)試驗(yàn)

應(yīng)屬Ⅰ型。Ⅰ型血清由中國藥品生物制品檢定所供應(yīng)或經(jīng)同意。

1.2.4　脾激活試驗(yàn)

用體重18～20g純種小白鼠（C3H、615或C57BL），試驗(yàn)及對(duì)照各10只，雌雄各半。試驗(yàn)組每只腹腔注射菌液0.5ml（15億菌），對(duì)照組注射同量生理鹽水，14天處死小白鼠，分別稱體重、脾重、計(jì)算脾指數(shù)，其指數(shù)應(yīng)不低于2.0。

脾指數(shù)=試驗(yàn)組脾重（mg）/總體重（g）÷對(duì)照組總脾重（mg）/總體重（g）

1.2.5　抑瘤試驗(yàn)（艾氏腹水癌）

用體重18～20g純種小白鼠（C3H、615、C57BL或K-LACA），試驗(yàn)及對(duì)照組各10只。雌雄各半，每只腹腔注射活的瘤細(xì)胞100萬/0.2ml（用傳代5～8天非血性腹水）。試驗(yàn)組于注射瘤細(xì)胞前1天及攻瘤后次日起，連續(xù)腹腔注射菌液0.25ml（15億）3～5次，每次間隔1天，對(duì)照組同時(shí)注射同量生理鹽水，由對(duì)照組小白鼠全部因癌性腹水死亡起點(diǎn)計(jì)算試驗(yàn)組小白鼠存活率，觀察期最長(zhǎng)30天，其存活率應(yīng)不低于70%。

1.2.6　毒性試驗(yàn)

小白鼠及分組要求同1.2.4項(xiàng)，稱總體重，試驗(yàn)組每只小白鼠腹腔注射0.5ml菌液（15億），對(duì)照組注射同量生理鹽水，觀察1周，到期稱總體重，不得較試驗(yàn)前減輕或死亡。

1.3　菌種保存

菌種應(yīng)凍干，置2～8℃保存。

2　菌苗制造

2.1　制造用培養(yǎng)基

可用蛋白胨、肝或酵母透析液培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基。

2.2　原液制造

2.2.1　接種

連續(xù)2～4次傳代的種子液接種于大瓶或培養(yǎng)罐，36～37℃厭氧培養(yǎng)4～6天。

2.2.2　采集

到期之培養(yǎng)物采集前逐瓶或逐罐鏡檢，有雜菌污染者廢棄。

2.2.3　殺菌

采集之菌體加入不超過0.5%(ml/ml)甲醛溶液，殺菌48小時(shí)后進(jìn)行無菌試驗(yàn)，不得有任何菌生長(zhǎng)。

2.2.4　菌液洗滌

無菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)離心沉淀后，用新鮮無菌生理鹽水洗滌3次，其最后一次用無菌生理鹽水做成懸液，加溫60～65℃1小時(shí)，逐瓶做無菌試驗(yàn)，合格后合并。

2.2.5　原液合并

無菌試驗(yàn)合格的菌液合并成批，放2～8℃保存。

2.3　原液檢定

2.3.1　鏡檢

菌形正常，至少觀察10個(gè)視野，應(yīng)無雜菌。

2.3.2　無菌試驗(yàn)

按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。

2.3.3　濃度測(cè)定

按中國細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。

2.3.4　毒性試驗(yàn)

按1.2.6項(xiàng)進(jìn)行。

2.3.5　脾激活試驗(yàn)

除脾指數(shù)應(yīng)不低于1.5個(gè)，余同1.2.4項(xiàng)。

2.3.6　抑瘤試驗(yàn)

同1.2.5項(xiàng)。樣品應(yīng)先按2.6項(xiàng)加溫處理。

2.4　菌液稀釋

2.4.1　稀釋

根據(jù)2.3.3項(xiàng)測(cè)定的原液濃度用無菌磷酸鹽緩沖液生理鹽水（pH7.2～7.4）稀釋成每ml含菌體60億±的菌苗。

2.4.2　分批

同一天由同一批原液稀釋的菌苗作為1批，如1批有數(shù)瓶，應(yīng)分亞批。

2.4.3　檢定

稀釋的菌苗應(yīng)逐瓶做無菌試驗(yàn)。

2.5　分裝

經(jīng)2.4.3項(xiàng)檢定合格的菌苗在充分搖勻下分裝。

2.6　加熱處理

分裝安瓿后立即60℃±2℃加熱30分鐘。

3　成品檢定

3.1　理化檢定

菌苗應(yīng)為乳白色懸液，pH6.6～7.2，無異味，無搖不散的菌塊及異物。

甲醛含量不得超過0.006%（ml/ml）。

3.2　無菌試驗(yàn)

按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。

3.3　脾激活試驗(yàn)

按2.3.5項(xiàng)進(jìn)行

3.4　抑瘤試驗(yàn)

按1.2.5項(xiàng)進(jìn)行（檢定合格的原液在半年內(nèi)分裝者，成品可不再作3.3～3.5項(xiàng)檢定）。

3.　5　濃度測(cè)定

按2.3.3項(xiàng)測(cè)定，每ml應(yīng)含菌體60億±10%。

3.6　安全試驗(yàn)

用18～20g白小鼠5只，每只皮下注射菌苗0.5ml，觀察7日，不得有局部膿腫或死亡。

4　保存與效期

應(yīng)保存于2～8℃。自原液采集之日起效期為2年半。