《中國生物制品規(guī)程》 皮上劃痕人用炭疽活菌苗制造及檢定規(guī)程

本品系用弱毒炭疽菌株制成的活芽胞懸液。專供預(yù)防炭疽病之用。

1　菌種

1.1　菌種來源

為無莢膜，水腫型，具有一定殘余毒力，免疫原性較好的A16R菌株。由中國藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。

1.2菌種應(yīng)以凍干法或用50%(ml/ml)甘油保存。每3~5年應(yīng)全面檢定其培養(yǎng)特性、殘余毒力、安全性及免疫力，建立種子批。生產(chǎn)前只檢查菌形，培養(yǎng)特性及噬菌體特異性。

1.3菌種檢定

1.3.1　培養(yǎng)及生化特性

在牛肉消化液瓊脂或其他適宜固體培養(yǎng)基上生長，菌落為灰白色，不透明，呈卷發(fā)狀。為革蘭氏陽性大桿菌，呈鏈狀排列。無運動力。能夠形成芽胞。液體培養(yǎng)呈絮狀發(fā)育，在血清培養(yǎng)基上不形成莢膜。能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，不分解水楊苷。

1.3.2　殘余毒力試驗

用體重350～400g健康豚鼠5只，各皮下注射0.5億/ml的牙包懸液1ml。另用體重18～20g小白鼠5只，各皮下注射0.5億/ml的芽胞懸液0.1ml。觀察10天，3只以上動物應(yīng)出現(xiàn)水腫，可有特異死亡。但臟器涂片只應(yīng)找到無莢膜的本菌。若全部動物不出現(xiàn)水腫，應(yīng)重試。重試仍無水腫，菌種不得用于生產(chǎn)。

1.3.3　安全試驗

用體重2.0～2.5kg分健康家兔10只，各皮下注射2.5億/ml的芽胞懸液1ml，觀察10天，在注射部位可出現(xiàn)水腫，全部動物應(yīng)活存。如有死亡，應(yīng)用同數(shù)動物重試，重試仍有死亡，菌種不得用于生產(chǎn)。

1.3.4　免疫力試驗

上述安全試驗動物于注射后18～20天，用炭疽毒菌攻擊，各皮下注射20個MLD。同時用同體重的健康家兔3只，各皮下注射1個MLD作為對照。觀察10天，對照動物死亡3只。試驗組保護60%；對照組死亡2只，試驗組保護80%為合格。對照動物死亡1只或無死亡，為對照不成立，應(yīng)重試。

2　制造

制造菌苗的工作室及設(shè)備應(yīng)當(dāng)專用，不得與其他細(xì)菌工作混用。生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，非制造菌苗用的其他炭疽菌株不得帶到生產(chǎn)工作室內(nèi)。

2.1　菌種

接種牛肉消化液瓊脂或其他適宜固體培養(yǎng)基，于34℃培育18～20小時，經(jīng)檢查為純菌者，保存于2～8℃，在2周內(nèi)供作生產(chǎn)種子用。

2.2　培養(yǎng)基

用pH7.2～7.4牛肉消化液瓊脂或其他培養(yǎng)基。

2.3　種子

將供制造用菌種，移種于牛肉消化液中。于34℃培育20～24小時，檢查其生長特性、菌形及純度，應(yīng)符合1.3.1項要求。

2.4　接種

經(jīng)檢查合格之種子培養(yǎng)物，接種于牛肉消化液瓊脂上，置33～34℃培育。成熟的典型芽胞達(dá)至80%以上、無雜菌者采集。

2.5　采集

將培養(yǎng)物刮入50%（ml/ml）甘油蒸餾水原液瓶內(nèi)，振搖使成均勻懸液。每瓶取樣按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行純菌試驗。

2.6　合并

將純菌試驗合格之原液進行合并分批，取樣做純菌試驗、濃度測定及活菌計數(shù)。

2.6.1　純菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

2.6.2　濃度測定

按中國細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)測定濃度。

2.6.3　活菌計數(shù)

取0.5億/ml的菌液1ml，按10倍系列稀釋至10-5。取10-5稀釋菌液接種5個平皿，每個平皿接種0.1ml。置37℃培育24小時，計算每ml菌苗的芽胞活存率。芽胞活存率在50%以上為合格。

2.7　稀釋分裝

2.7.1　稀釋

用滅菌的50%甘油蒸餾水將原液稀釋成每ml含芽胞40億個，即為皮上劃痕用菌苗。同批原液稀釋之菌苗為作1批。稀釋若干大瓶時，應(yīng)按瓶號分為亞批。

2.7.2　分裝

皮上劃痕用菌苗按20人份/ml分裝。規(guī)格為每安瓿1或2ml，抽樣進行成品檢定。

3　成品檢定

3.1　物理檢查

應(yīng)為灰白色之均勻懸液，無異物及搖不散之菌塊。

3.2　純菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

3.3　濃度測定

按中國細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)測定濃度，應(yīng)為每ml含菌40億±20%

3.4　活菌計數(shù)

按2.6.3項進行。

3.5　安全試驗

每批菌苗用體重2.0～2.5kg，健康家兔5只，各皮下注射2.5億/ml的芽胞懸液1ml。觀察10天?？捎兴[，全部動物應(yīng)活存。如有死亡，應(yīng)用加倍量動物重試。如仍有死亡，判為不合格。

3.6　免疫力試驗

每5批菌苗或不足5批者，至少抽檢1批（可利用安全試驗的動物）按1.3.4項進行。

4　保存與效期

應(yīng)保存于2～8℃。自檢定合格之日起效期為2年。