《細(xì)胞和分子免疫學(xué)》 二、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中第二信使含量的測定

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，第二信使（second messenger）含量的高低同信號傳遞密切相關(guān)。目前測定的第二信使主要包括細(xì)胞內(nèi)Ca2+（[Ca2+]i）、二酰基甘油（DAG）、三磷酸肌醇（IP3）以及環(huán)腺苷酸（cAMP）等。

1.[Ca2+]i的測定　細(xì)胞內(nèi)Ca2+的測定方法有原子吸收光譜法、離子微電極測定法、放射示蹤法及標(biāo)記示蹤法等。目前常用標(biāo)記示蹤法，即用熒光探針標(biāo)記靶細(xì)胞。常用的熒光探針有quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-1等。Fura-2/Am和Indo-1較為敏感。

2.IP3的測定　采用3H-TdR標(biāo)記的肌醇標(biāo)記靶細(xì)胞后，用不同的刺激劑刺激細(xì)胞，分離磷脂酰肌醇混合物，通過陰離子交換層析柱（Serva公司Dowex1*8）分離洗脫，收集IP3洗脫峰后進(jìn)行液閃測定。此外，還可以使用Amersham公司生產(chǎn)的D-myo-IP3[3H]分析系統(tǒng)直接測定粗提物中的IP3含量，此方法簡易、敏感。

3.DAG的測定　首先提取含DAG的樣品，然后采用Amersham公司生產(chǎn)的DAG分析系統(tǒng)進(jìn)行測定。此系統(tǒng)測定的原理是用DAG激酶催化底物DAG，使之發(fā)生磷酸化，外源加入32γ-ATP，最后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離后測定放射性含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算出樣品中DAG的含量。

4.cAMP的測定　可選擇不同的方法：（1）cAMP[3H]分析系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是放射性半衰期長，可用于大量樣品的分析；（2）cAMP[125I]分析系統(tǒng)，用于小量樣品的分析；（3）cAMp ILISA測定方法，此方法簡便、敏感。