重視β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)研究

近年來研究發(fā)現(xiàn)，同一品種不同廠家的產(chǎn)品、同一品種不同批號的產(chǎn)品，有的易發(fā)生過敏反應(yīng)，有的則不易發(fā)生過敏反應(yīng)。也就是說，藥物的質(zhì)量直接影響著過敏反應(yīng)的發(fā)生率。研究表明，過敏反應(yīng)的發(fā)生率與藥品中高分子雜質(zhì)的含量密切：相關(guān)高分子雜質(zhì)的含量越低，過敏反應(yīng)的發(fā)生率也就越低；高分子雜質(zhì)的含量越高，過敏反應(yīng)的發(fā)生率也就越高。

高分子雜質(zhì)是主要過敏原

目前，我國科研人員經(jīng)過深入的研究，已從頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢他啶等四種第三代頭孢菌素中分離收集到了能引發(fā)動(dòng)物過敏反應(yīng)的基本無抗菌活性的聚合物。利用動(dòng)物口服主動(dòng)過敏反應(yīng)模型，確證引發(fā)青霉素V鉀、阿莫西林等口服青霉素過敏反應(yīng)的主要過敏原是它們的高分子雜質(zhì)，而頭孢菌素和青霉素本身并不引發(fā)過敏反應(yīng)，腸道吸收不會(huì)影響其過敏特性。因此，在研制生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類抗生素過程中，必須對其中的高分子雜質(zhì)進(jìn)行研究，以指導(dǎo)優(yōu)化制備工藝、確定適宜的貯藏條件和使用方法，并嚴(yán)格控制其含量，以減少臨床過敏反應(yīng)的發(fā)生。隨著現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的不斷改進(jìn)和提高，目前產(chǎn)品中外源性雜質(zhì)日趨減少，對內(nèi)源性聚合物的控制是當(dāng)前抗生素藥物高分子雜質(zhì)控制的重點(diǎn)。

凝膠色譜法具明顯優(yōu)勢

高分子雜質(zhì)的分離分析方法主要有：反相色譜法、離子交換色譜法和凝膠色譜法（分子排阻色譜法）。由于結(jié)構(gòu)不同的高分子雜質(zhì)通常具有相似的生物學(xué)特性（過敏性），因此在藥品質(zhì)量控制中一般只需控制藥品中高分子雜質(zhì)的總量而不必控制不同結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)。因此，根據(jù)樣品分子量差異進(jìn)行分離的凝膠色譜法則具有明顯的優(yōu)勢。

凝膠色譜法（分子排阻色譜法）是根據(jù)分子大小進(jìn)行分離的一種液相色譜技術(shù)。藥物分子進(jìn)入凝膠孔徑內(nèi)部，而高分子雜質(zhì)則被排阻在外，在色譜過程中不被保留，最早被洗脫出來，保留時(shí)間較短，而藥物被保留，保留時(shí)間較長。

根據(jù)β-內(nèi)酰胺類抗生素和其高分子雜質(zhì)的分子量，研究人員比較了數(shù)種凝膠介質(zhì)，最后選用SephadexG-10作為β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)分離色譜系統(tǒng)的凝膠介質(zhì)，發(fā)現(xiàn)SephadexG-10排阻分子量在1000道爾頓左右。

凝膠色譜方法驗(yàn)證的內(nèi)容主要有：系統(tǒng)適用性試驗(yàn)（理論板數(shù)、拖尾因子、精密度和分離度等）、對照溶液的線性、對照溶液的精密度（RSD）、最低檢測限與定量限、F值的重現(xiàn)性、聚合物測定結(jié)果的重現(xiàn)性等。

β-內(nèi)酰胺類抗生素的高分子雜質(zhì)具有高度的不均一性和不確定性，故無法制備對照品，不能采用對照品法定量。中國藥品生物制品檢定所金少鴻等研究者，根據(jù)β-內(nèi)酰胺類抗生素在不同離子強(qiáng)度的介質(zhì)中具有不同表現(xiàn)狀態(tài)的性質(zhì)，首次建立了凝膠色譜自身對照外標(biāo)法定量測定β-內(nèi)酰胺類抗生素中的聚合物。此方法已經(jīng)載入《中國藥典》2000年版和2005年版，用于國產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類抗生素的質(zhì)量控制，并已被國內(nèi)外β-內(nèi)酰胺類抗生素生產(chǎn)廠家廣泛使用。

質(zhì)控研究中存在問題

目前，β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)質(zhì)量控制研究中存在著一些問題，應(yīng)引起注意：因某些β-內(nèi)酰胺類抗生素在特定條件下不能完全締合，無法采用“自身”對照外標(biāo)法定量，故不再繼續(xù)進(jìn)行研究；系統(tǒng)適用性試驗(yàn)不符合要求，例如，對照溶液與藍(lán)色葡聚糖2000峰的保留時(shí)間不一致，對照溶液峰不能重疊或峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差大于5.0%，分離度不符合要求等；對照品制備方法錯(cuò)誤，如采用在溶液狀態(tài)下加熱或紫外光照射的方法制備β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物對照品；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中聚合物的限度較寬，無科研依據(jù)。

四方面值得關(guān)注

目前，β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)的控制研究有四方面的問題須引起藥品研制、生產(chǎn)人員的關(guān)注。

*高分子雜質(zhì)影響因素

首先要從產(chǎn)品的制備工藝和分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析可能產(chǎn)生的高分子雜質(zhì)，并研究溫度、光照、水分及溶液pH值等對高分子雜質(zhì)含量的影響，以明確高分子雜質(zhì)產(chǎn)生的影響因素，用于指導(dǎo)優(yōu)化制備工藝、選擇適宜的貯藏條件、制定有效的質(zhì)量控制指標(biāo)和限度，以及確定合適的臨床使用方法。

*檢查方法

高分子雜質(zhì)的檢查方法通常應(yīng)參照中國藥典的方法，重點(diǎn)考察系統(tǒng)適用性，并要進(jìn)行方法驗(yàn)證，這一點(diǎn)對新藥尤為重要。

*對照品的制備

如果某些β-內(nèi)酰胺類抗生素在特定條件下不能完全締合，無法采用“自身”對照外標(biāo)法定量時(shí)，可以用結(jié)構(gòu)與研制產(chǎn)品類似，且能夠完全締合的其他藥物制備對照品，進(jìn)行自身對照外標(biāo)法定量，但在計(jì)算結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮二者分子量的差異。例如，硫酸頭孢噻利在特定條件下不能完全締合，可以選擇結(jié)構(gòu)與頭孢噻利類似的頭孢曲松制備對照品進(jìn)行定量；硫酸頭孢匹羅可以采用頭孢他啶制備對照品進(jìn)行定量。

*質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

《中國藥典》2005年版中供注射用頭孢類抗生素原料藥和注射劑大都納入了聚合物檢查項(xiàng)，青霉素類抗生素口服原料藥和制劑也定入了聚合物檢查項(xiàng)。因β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)的含量與生產(chǎn)工藝直接相關(guān)，同一產(chǎn)品采用不同的生產(chǎn)工藝，其聚合物的含量也不同，且高分子雜質(zhì)的含量直接影響過敏反應(yīng)的發(fā)生率，故在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中控制高分子雜質(zhì)的含量是控制產(chǎn)品質(zhì)量、降低過敏反應(yīng)發(fā)生率，保障臨床用藥安全的有效措施。通常注冊申請人應(yīng)考慮將高分子雜質(zhì)檢查納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并制定合理的限度；或作為企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢查項(xiàng)目，高分子雜質(zhì)的限度與其他雜質(zhì)一樣，同樣要有安全性研究結(jié)果的支持。

相關(guān)鏈接：

高分子雜質(zhì)系指藥物中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)的總稱。分子量一般在1000~5000道爾頓，個(gè)別可至10000道爾頓。

β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)有外源性和內(nèi)源性兩種。外源性一般源于發(fā)酵工藝，為蛋白、多肽、多糖等雜質(zhì)與抗生素結(jié)合的雜質(zhì)。內(nèi)源性系指抗生素藥物自身聚合的產(chǎn)物。聚合物既可來自生產(chǎn)過程，又可在貯藏過程中形成，甚至在用藥時(shí)也可以產(chǎn)生。如阿莫西林顆粒在采用開水沖服時(shí)，其高分子雜質(zhì)可增加100倍。

β-內(nèi)酰胺類抗生素主要包括青霉素和頭孢菌素兩大類，除青霉素G和V外，臨床中常用的β-內(nèi)酰胺類抗生素均為半合抗生素，故除青霉素G和V中還含有少量青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽外，其他產(chǎn)品中的高分子雜質(zhì)主要是聚合物。