中藥中總鞣質(zhì)含量測(cè)定方法比較

鞣質(zhì)又稱單寧，是一類比較復(fù)雜的具有沉淀蛋白質(zhì)性質(zhì)的水溶性多元酚類化合物，廣泛存在于植物中。以前對(duì)鞣質(zhì)的研究較少，多認(rèn)為是無用的雜質(zhì)被除去。近些年來，隨著分析、分離手段的進(jìn)步，逐漸發(fā)現(xiàn)鞣質(zhì)具有許多藥理活性，可以抗脂質(zhì)過氧化、清除活性氧，具有抗艾滋病病毒（HIV）和抗腫瘤的作用，使其在臨床中日益受到重視，也同時(shí)對(duì)鞣質(zhì)的含量測(cè)定方法提出了更高的要求。

皮粉法

鞣質(zhì)是多元酚類，分子中有許多的酚羥基可以與蛋白質(zhì)的酰胺形成氫鍵結(jié)合成不溶于水的沉淀，利用這個(gè)性質(zhì)可以使鞣質(zhì)沉淀下來，用重量法測(cè)定鞣質(zhì)的含量。皮粉法是現(xiàn)在國(guó)際上較公認(rèn)的測(cè)定方法。皮粉法的缺點(diǎn)主要是樣品耗用量大，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，而且沒有選擇性，其測(cè)定結(jié)果往往偏高，故一般只適用于測(cè)定鞣質(zhì)含量高的生藥，樣品較少或含量低的則不適于測(cè)定。而且皮粉試劑的供應(yīng)和質(zhì)量都較難保證。皮粉法用重量法測(cè)定樣品須經(jīng)過濾、干燥、稱量，所以需要的樣品量較大，而且實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，一般樣品分析需20小時(shí)左右，而且皮粉的選擇性較差，測(cè)定結(jié)果偏高。所以皮粉法的使用受到一定的限制。除了皮粉可以作沉淀劑以外，還可以用其他代替，如有報(bào)道稱用三價(jià)離子取代皮粉與鞣質(zhì)結(jié)合進(jìn)行重量分析，測(cè)定雙子葉植物中鞣質(zhì)的含量。

干酪素法

干酪素主要成分是乳液中的酪蛋白，為含磷蛋白質(zhì)。分子量約75，000～375，000。干酪素可以有選擇性地結(jié)合有生物活性的鞣質(zhì)，與無生理活性的鞣質(zhì)如鞣干則不產(chǎn)生沉淀，所以干酪素法的選擇性較皮粉法好，一般適用于鞣質(zhì)含量較低的鞣質(zhì)。鞣質(zhì)在一定的pH值條件下與Folin試劑反應(yīng)，利用分光光度法測(cè)定其吸收值，再用干酪素沉淀鞣質(zhì)，再用Folin試劑測(cè)定供試品中共存雜質(zhì)的吸收度，二者之差與鞣質(zhì)的濃度之間呈線性關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)老鸛草的鞣質(zhì)分別采用皮粉法和干酪素法測(cè)量，皮粉法測(cè)量結(jié)果是6.84%，干酪素法測(cè)量的結(jié)果是3.32%，表明干酪素法測(cè)定的結(jié)果更有針對(duì)性，一般低于皮粉法測(cè)定結(jié)果，而且重復(fù)性好。

磷鉬鎢酸-皮粉比色法

《英國(guó)藥典》2002版鞣質(zhì)測(cè)定法附錄采用的是磷鉬鎢酸-皮粉比色法。即利用鞣質(zhì)在堿性溶液中將磷鉬鎢酸還原，產(chǎn)生深藍(lán)色，其吸收度與含量成正比，采用比色法在760納米下測(cè)定。其中，以焦性沒食子酸為對(duì)照，測(cè)定總酚和不被皮粉吸附的酚，二者之差計(jì)為鞣質(zhì)的含量。其中磷鉬鎢酸的配制方法為取100克鎢酸鈉固體、25克鉬酸鹽固體加入700毫升水中，加入100毫升鹽酸、50毫升磷酸，加熱10小時(shí)，再加入150克硫酸鋰、50毫升水和0.2毫升溴，煮沸除去多余的溴（大約15分鐘）溶液的顏色應(yīng)該為黃色。

改進(jìn)的干酪素法

改進(jìn)的干酪素法其關(guān)鍵步驟是以干酪素代替皮粉，采用磷鉬鎢酸比色法測(cè)定。而且根據(jù)鞣質(zhì)加熱不穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，藥材樣品提取采用浸泡過液代替加熱回流提取，提取較完全、方便。有研究表明，pH值在4.8～5.3之間為蛋白質(zhì)沉淀的最佳條件。英國(guó)《藥典》采用的是在水溶液中加入皮粉，選擇在pH=5的緩沖液中沉淀鞣質(zhì)。改進(jìn)的干酪素法采用與焦沒食子酸結(jié)構(gòu)相近的沒食子酸、鞣酸、d-兒茶素代替，其性質(zhì)更穩(wěn)定，更接近中藥的中鞣質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2005版《藥典》比色法

2005版《藥典》將2000版《藥典》皮粉重量法改為磷鉬鎢酸比色法。用沒食子酸作為對(duì)照品，用磷鉬鎢酸比色法進(jìn)行測(cè)定鞣質(zhì)含量。用水冷浸過液提取鞣質(zhì)，再用干酪素沉淀非鞣質(zhì)類成分，兩者之差即為鞣質(zhì)含量。藥典含測(cè)方法改變之后較原來皮粉重量法準(zhǔn)確，重復(fù)性及靈敏度高。

絡(luò)合量法

因?yàn)槎嘣涌膳c金屬離子形成多核絡(luò)合物，故鞣質(zhì)能與若干金屬離子生成沉淀。因此可利用這個(gè)性質(zhì)測(cè)定未知物中鞣質(zhì)含量。此方法簡(jiǎn)單，且避免了沉淀轉(zhuǎn)移，洗滌等繁瑣的程序，還可省略空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。因?yàn)轺焚|(zhì)化學(xué)性質(zhì)的復(fù)雜，目前尚難以絡(luò)合沉淀反應(yīng)的克分子關(guān)系來推斷鞣質(zhì)的含量。研究發(fā)現(xiàn)，用絡(luò)合滴定法測(cè)量綠茶提取物中鞣質(zhì)的含量，與皮粉法相比沒有顯著性差異。

氧化還原滴定法

鞣質(zhì)為多酚類化合物，具有很好的還原性，在常溫及酸性溶液中可被高錳酸鉀氧化，以此測(cè)定鞣質(zhì)的含量。此法較皮粉法簡(jiǎn)單、迅速，但高錳酸鉀氧化無專屬性，測(cè)定結(jié)果容易偏大。除了高錳酸鉀外，常用的氧化還原滴定劑還有硫酸鈰等。

比色法

該方法目前應(yīng)用得最為廣泛。常用的顯色劑有氯化鐵、氯化鐵-1、10二氮雜菲、Folin-ciocaltru試劑、5%鹽酸-丁醇、甲胺基粉-重鉻酸鉀溶液、Folin-DAB8試劑、Folin-Denis試劑、偏釩酸銨等。這些顯色劑的檢測(cè)范圍一般在500～700納米之間，已被廣泛用于果汁、果渣、茶葉和中藥中鞣質(zhì)的測(cè)量。有研究人員對(duì)啤酒花中丹寧的含量用幾種不同方法進(jìn)行測(cè)量，比較發(fā)現(xiàn)，高錳酸鉀法迅速、簡(jiǎn)便、快捷、節(jié)省試劑；EDTA滴定法較KMnO4滴定法具有準(zhǔn)確、精密、滴定終點(diǎn)清晰、明顯等特點(diǎn)；六氰含鐵（Ⅲ）酸亞鐵鉀吸光光度法較鎢酸鈉吸光光度法具有靈敏度高，色澤穩(wěn)定，線形范圍大、檢測(cè)濃度低等優(yōu)點(diǎn)。比色法的不足在于配制Folin-Denis試劑較麻煩，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，而且遇到其他還原性性物質(zhì)有干擾。

紫外測(cè)定

鞣質(zhì)在紫外區(qū)275納米左右有較強(qiáng)的特征吸收，可以用紫外法對(duì)鞣質(zhì)進(jìn)行定量分析。此種方法較簡(jiǎn)單，迅速。有科研人員利用紫外分光光度法，以鞣酸為對(duì)照，在276納米下測(cè)定五倍子、訶子（水解鞣質(zhì)）、兒茶、大黃（縮合鞣質(zhì)）鞣質(zhì)的含量。結(jié)果表明，此種方法測(cè)定鞣質(zhì)的含量與皮粉法和絡(luò)合量法的結(jié)果相近，說明此方法具有一定的可行性。

中藥總鞣質(zhì)測(cè)量的各種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和不足。對(duì)于不同成分應(yīng)根據(jù)其特點(diǎn)選擇適宜的測(cè)定方法。對(duì)于測(cè)定鞣質(zhì)單一的成分，近些年發(fā)展起來的高效液相技術(shù)，既有分離又有檢測(cè)功能，結(jié)果有效而且準(zhǔn)確，為鞣質(zhì)定量分析開辟了新的前景。