生化生產(chǎn)過(guò)程中的分離技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)介

許多年以來(lái)，許多有遠(yuǎn)見(jiàn)卓識(shí)的工程師和觀察家們都在敦促生物制藥界接受新的生產(chǎn)技術(shù)，就象食品和化學(xué)行業(yè)曾經(jīng)所做的那樣。就連美國(guó)食品與藥物管理部門(mén)也通過(guò)屬下的PAT（Process Analytical Technology）來(lái)激勵(lì)生物制藥廠商們，希望他們變得有創(chuàng)造力、更有實(shí)驗(yàn)精神一些。

然而，規(guī)則的不確定性卻使得所有人變得膽小。藥品的安全論證需要高額的花費(fèi)，且面臨著很大危險(xiǎn)，因此許多成功的生物藥業(yè)公司拒絕了(至少在公開(kāi)場(chǎng)合中)生產(chǎn)技術(shù)的革新。

就算是保守的主流廠商在某些領(lǐng)域?qū)?lái)也會(huì)慢慢開(kāi)始進(jìn)行生產(chǎn)技術(shù)的改革，例如：轉(zhuǎn)基因和基因治療、血漿生產(chǎn)等等。但為止，技術(shù)裝置改造仍然偏重于對(duì)那些使用了十年以上的部分進(jìn)行更新。無(wú)論如何，些變革都減少了生產(chǎn)開(kāi)支，加速了產(chǎn)品的商業(yè)化進(jìn)程，使得制造商們獲得了更多的利潤(rùn)或更完善的管理。

即用即拋的設(shè)備

因?yàn)閮艋^(guò)程的費(fèi)用和相關(guān)的認(rèn)證問(wèn)題，廠商非常喜歡用一次性的東西，從過(guò)濾器到包裝都是用完就扔，這樣不僅避免了交叉污染，更重要的是完全不需要關(guān)心它的凈化處理了。

如果將即用即拋型的產(chǎn)品擴(kuò)大到連接器、閥門(mén)和管子的話，會(huì)更加受到廠商的歡迎。世界領(lǐng)先的過(guò)濾器和層析裝置的供應(yīng)商，包括Pall Corp.、Sartorius、Millipore Corp和Meissner Filtration 都已經(jīng)開(kāi)始致力于一次性產(chǎn)品的研制，盡管這些舉動(dòng)受到了經(jīng)濟(jì)學(xué)家的警告。

完全一次性的生產(chǎn)裝置盡管還沒(méi)有在生化制藥領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)，但是已經(jīng)有了很大的成果。對(duì)于一些中、小規(guī)模的廠商而言，一次性過(guò)濾系統(tǒng)、層析系統(tǒng)和濃縮/淡化系統(tǒng)的聯(lián)合在技術(shù)上已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)了。

“是否生產(chǎn)一次性產(chǎn)品通?；谝韵聨追N考慮：產(chǎn)品價(jià)值、生產(chǎn)成本和營(yíng)業(yè)間接成本。”P(pán)all公司的Derek Pendlebury.博士說(shuō)，“十五年前每人說(shuō)到一次性產(chǎn)品時(shí)總是說(shuō)‘好主意，但我不感興趣’，可是目前的形勢(shì)使人們改變了看法?！?/p>

以前說(shuō)到凈化主要指加工過(guò)程的凈化，針對(duì)的是原材料和消耗品。今天，制藥廠還需要考慮對(duì)裝置和人員進(jìn)行凈化。凈化所花的時(shí)間54%花在了生產(chǎn)裝置上、剩下的36％用于原材料凈化，10%用于人員凈化。

為了降低整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程的消耗，生產(chǎn)商可以采取兩種方法，一是通過(guò)增加批次來(lái)降低單批產(chǎn)品的成本，二是增加批次規(guī)模。因?yàn)橘I(mǎi)方往往限定好了產(chǎn)品的批次規(guī)模，所以廠商只有增加批次一個(gè)選擇了。因?yàn)榛ㄔ谏a(chǎn)裝置凈化上的時(shí)間無(wú)法縮短，所以廠商只有盡可能的使用一次性的凈化設(shè)備來(lái)縮短剩下的時(shí)間。

層析與過(guò)濾技術(shù)相聯(lián)合

技術(shù)上的聯(lián)合操作－例如離心過(guò)濾法－提高了生化生產(chǎn)的效率。值得一提的是膜層析（MC）法，它使得過(guò)濾和化學(xué)粘附能夠通過(guò)一臺(tái)設(shè)備完成。

在一些特別的應(yīng)用領(lǐng)域，例如濾清或過(guò)濾微生物、病菌時(shí)，可以用離子交換膜來(lái)代替原來(lái)的層析柱充當(dāng)MC的過(guò)濾介質(zhì)。

因?yàn)楦裟ぬ?，人們將它們疊起來(lái)以達(dá)到想要的效果。有人還發(fā)明了螺旋式的薄膜來(lái)實(shí)現(xiàn)一些特別的應(yīng)用。

最近，一些科學(xué)家們又開(kāi)始將注意力轉(zhuǎn)移到傳統(tǒng)的層析柱技術(shù)上去，例如Sartorius就開(kāi)始重新研制一些層析柱式的MC，就象20年前所做的一樣，但是不同的是，它更重視MC的蛋白質(zhì)粘附能力。

雖然MC法目前仍然比不上經(jīng)典方法，但是MC可以提供令人驚訝的快速分離效果。

MC法和凝膠法是互為補(bǔ)充的。Sartorus北美區(qū)的副總裁Maik Jornitz如是說(shuō)?！安僮髡吆芟矚g將它們聯(lián)合使用，因?yàn)檫@樣既簡(jiǎn)單又快捷，還可重復(fù)使用?！盡C的介質(zhì)可以使用1000次以上仍然保持比層析凝膠更好的凈化性能。

雖然過(guò)濾性能仍然不如傳統(tǒng)方法，但是MC法勝在速度很快，尤其是在過(guò)濾低濃度的液體的時(shí)候。有種特殊的MC還裝備了陽(yáng)離子交換器用來(lái)去除內(nèi)毒素。

Mustang是Pall公司的另一個(gè)膜層析產(chǎn)品，它以低蛋白粘附力的硫代聚醚為主體，加上高效陽(yáng)離子交換劑用于低聚核酐酸的濾清和凈化。這種膜層析使得在制造疫苗的過(guò)程中，蛋白質(zhì)仍可保留。

老方法，新技術(shù)

生化分離層析儀的效率隨著新材料的出現(xiàn)也得到了提高。例如，傳統(tǒng)的凝膠介質(zhì)是很難以增加高度的，柱體變高時(shí)，巨大的壓力會(huì)使得凝膠壓縮，從而改變它的吸收特性。

“唯一的辦法是增加柱體直徑，”阿拉巴馬大學(xué)化學(xué)系的Robin Rogers博士說(shuō)，“但是這樣就完全不能保證液體的均勻滲透了，層析的效果會(huì)大打折扣。”正是基于這個(gè)觀點(diǎn)，生化產(chǎn)品的制造商們只能去增加層析柱數(shù)量來(lái)解決問(wèn)題。

可以彎曲、折疊或切除部分的剛性材料解決了不少軟凝膠面臨的加工問(wèn)題。例如，Milipores出產(chǎn)的層析介質(zhì)使用了一種具有機(jī)械剛性的玻璃基材料，相比其它介質(zhì)，它在各種壓力下，仍能保持穩(wěn)定的滲透和吸附性能。

對(duì)于某些產(chǎn)品例如單克隆性抗體而言，它們成本昂貴、競(jìng)爭(zhēng)激烈，而產(chǎn)品量又很小，使用傳統(tǒng)的層析設(shè)備往往覺(jué)得過(guò)于奢侈。

但是對(duì)于農(nóng)業(yè)生化加工廠而言，層析設(shè)備是必需的。產(chǎn)出蛋白質(zhì)的玉米、大米、馬鈴薯和其它的農(nóng)產(chǎn)品收割量都是巨大的，農(nóng)產(chǎn)品的蛋白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)十分精細(xì)，然而生產(chǎn)過(guò)程卻很簡(jiǎn)單，要分離出蛋白質(zhì)通常只需要萃取或過(guò)濾就可以了。

例如，SemBioSys利用連續(xù)過(guò)濾的方法從紅花種子里分離出了一種治療性的蛋白質(zhì)。SemBioSys將這個(gè)過(guò)程命名為StratoSome。

為了研制可注射的配方，SemBioSys將蛋白質(zhì)從紅花種子中提取出來(lái)，先離心，然后進(jìn)入層析柱過(guò)濾。同時(shí)也對(duì)種子本身進(jìn)行改造，改良后的種子可以通過(guò)傳統(tǒng)的榨取法提取出更純凈的蛋白質(zhì)。

萃取法仍未被充分利用

萃取，雖然主要應(yīng)用仍是化學(xué)和食品加工過(guò)程，但是也開(kāi)始進(jìn)入了生化加工領(lǐng)域?？墒?，盡管一些公司，包括Genentech，已經(jīng)發(fā)表了一些關(guān)于蛋白質(zhì)萃取的文章，但是絕大部分的工作仍然只是在大學(xué)實(shí)驗(yàn)室里開(kāi)展?？梢钥隙ǖ氖?，從商業(yè)角度來(lái)說(shuō)，層析法的利潤(rùn)比萃取法要大的多。

但令人驚訝的是，如果我們對(duì)層析法和萃取法的相關(guān)消耗做一個(gè)比較就會(huì)看到，傳統(tǒng)的層析介質(zhì)每公升要花幾百美金，特殊材料則花的更多；而萃取法的消耗就只有溶劑。

而且萃取法相比層析法還有更多的優(yōu)勢(shì)：傳質(zhì)迅速，很容易提高規(guī)模，消耗很少并且不受過(guò)程中產(chǎn)生的臟水的影響。此外，萃取法可以從蛋白質(zhì)中分離細(xì)胞殘骸，從而省掉了一開(kāi)始的過(guò)濾/凈化步驟。

為什么萃取法的推廣會(huì)遇到這么大的阻力呢？Bobin

Rogers博士是這樣解釋的，“萃取法和層析法相比，它的最初設(shè)計(jì)要難的多，萃取法的實(shí)現(xiàn)需要工程師的幫忙，而不是象層析設(shè)備那樣買(mǎi)回來(lái)就能用。”

他補(bǔ)充說(shuō)，“而且，生化學(xué)家們個(gè)個(gè)都知道層析是怎么回事?！?/p>

毫無(wú)疑問(wèn)，隨著新的蛋白質(zhì)藥品的出現(xiàn)，生化加工廠需要重新考慮更簡(jiǎn)單的加工方法，例如萃取?！爸委熜缘鞍桩a(chǎn)品的出現(xiàn)，使得每次治療都需要幾克的蛋白質(zhì)藥劑，現(xiàn)有的生產(chǎn)技術(shù)顯得有些跟不上了?！?/p>

兩相萃取液（ATPE）的成分包括水，聚乙二醇（PEG）和鹽、PEG/醣類，PEG/共聚物，水/鹽/酒精，和其它種種，ATPE可以將蛋白質(zhì)從其它有機(jī)物和細(xì)胞殘骸中分離出來(lái)。例如，Virginia科技的張先生就用ATPE從蛋白/煙葉勻漿中獲得了87%純度的蛋白溶解酵素。他所用的ATPE成分并不復(fù)雜，其中包括水和PEG、糊精、鹽的混合物。

張先生并不知道到底哪一相提取出了蛋白質(zhì)，但是只要有一相能夠提取，而另一相不能，蛋白質(zhì)的提取就是可行的。這種方法簡(jiǎn)單、廉價(jià)，完全有取代傳統(tǒng)蛋白質(zhì)提純方法的可能。

一個(gè)新的賭注

DNA產(chǎn)品的研制，不僅面臨著技術(shù)上的問(wèn)題，也面臨著概念上的轉(zhuǎn)換。生物工程學(xué)家們?cè)谘芯康鞍踪|(zhì)時(shí)，將DNA視為雜質(zhì)；當(dāng)研究DNA時(shí)，蛋白質(zhì)又變成了雜質(zhì)。在分離制造DNA疫苗所需的質(zhì)粒DNA

時(shí)，層析法最為好用。但是質(zhì)粒DNA的生物藥效率很低，這就意味著以它來(lái)制藥的話，劑量和藥廠產(chǎn)量都會(huì)很大。

用層析法分離質(zhì)粒DNA的話成本太昂貴了，默克公司的Russ

Lander博士發(fā)現(xiàn)用甲基溴化銨（CTAB）－一種陽(yáng)離子洗滌劑，可以將質(zhì)粒DNA洗下來(lái)，而將蛋白質(zhì)、RNA和內(nèi)毒素留在溶液中。

標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒體提純過(guò)程包括陽(yáng)離子交換層析和反相層析。“我們已經(jīng)將這兩種比較昂貴的方法換成了相對(duì)便宜的手段?！盠ander說(shuō)，“我們?cè)贑TAB這種新技術(shù)上下了很大的賭注。”

但是就算用萃取法代替層析法，質(zhì)粒體的提取仍然有其障礙性。用均質(zhì)器來(lái)進(jìn)行細(xì)胞溶菌作用是不可能的。“必須要使用化學(xué)方法?！盠and說(shuō)。

沉淀下來(lái)以后，人們使用硅吸附劑來(lái)對(duì)質(zhì)粒體進(jìn)行精制，LRA是其中的一種硅吸附劑。Land承認(rèn)，用這種吸附劑效果非常好，本來(lái)只是希望可以去除內(nèi)毒素的，但是他發(fā)現(xiàn)，LRA將很多其它的雜質(zhì)也一并吸附掉了。