《生物化學(xué)與分子生物學(xué)》 二、DNA復(fù)制的起始階段：

(一)DNA復(fù)制的起始點

很多實驗都證明：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復(fù)制起始點(originof replication)常用ori或o表示。細胞中的DNA復(fù)制一經(jīng)開始就會連續(xù)復(fù)制下去，直至完成細胞中全部基因組DNA的復(fù)制。DNA復(fù)制從起始點開始直到終點為止，每個這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元(replicon)。在原核細胞中，每個DNA分子只有一個復(fù)制起始點，因而只有一個復(fù)制子，而在真核生物中，DNA的復(fù)制是從許多起始點同時開始的，所以每個DNA分子上有許多個復(fù)制子。

DNA復(fù)制起始點有結(jié)構(gòu)上的特殊性，例如：大腸桿菌染色體DNA復(fù)制起始點Oric由422個核苷酸組成，是一系列對稱排列的反向重復(fù)序列，即回文結(jié)構(gòu)(palindrome)，其中有9個核苷酸或13個核苷酸組成的保守序列，這些部位是大腸桿菌中DnaA蛋白識別的位置，大腸桿菌染色體DNA是環(huán)狀雙鏈DNA，它的復(fù)制是典型的“θ”型復(fù)制(由于形狀像希臘字母θ)。從一個起點開始，同時向兩個方向進行復(fù)制，當(dāng)兩個復(fù)制方向相遇時，復(fù)制就停止。而有些生物的DNA復(fù)制起始區(qū)是一段富含A·T的區(qū)段。這些特殊的結(jié)構(gòu)對于在DNA復(fù)制起始過程中參與的酶和許多蛋白質(zhì)分子的識別和結(jié)合都是必須的。

(二)DNA復(fù)制的方向：

(1)定點開始雙向復(fù)制：

這是原核生物和真核生物DNA復(fù)制最主要的形式，從一個特定位點解鏈，沿著兩個相反的方向各生長出兩條鏈，形成一個復(fù)制泡，用電子顯微鏡可以觀察到復(fù)制泡的存在(圖16－5)。

圖16－5　SV40DNA；復(fù)制泡生長的電鏡圖譜

(2)定點開始單向復(fù)制：

質(zhì)粒colE1是個典型的例子，復(fù)制從一個起始點開始，以同一方向生長出兩條鏈，形成一個復(fù)制叉(replication fork)。

(3)兩點開始單向復(fù)制：

腺病毒DNA的復(fù)制是從兩個起點開始的，形成兩個復(fù)制叉，各以一個單一方向復(fù)制出一條新鏈(圖16－6)。

圖16-6　DNA的半不連續(xù)復(fù)制和復(fù)制泡的形成

總之DNA復(fù)制的起點及方向不僅原核細胞與真核細胞不同，就是同屬于原核生物和真核生物的不同種屬也有相當(dāng)大的差異(圖16－7)。

圖16-7　DNA鏈生長方向的三種機制

(三)DNA復(fù)制起始引發(fā)體的形成及所參與的酶和蛋白質(zhì)：

1.解鏈酶(helicase)

DNA開始復(fù)制時首先在起始點處解開雙鏈，反應(yīng)是在一種解鏈酶(helicase)的催化下進行的。解鏈酶需要ATP分解供給能量。大腸桿菌中DnaB蛋白就有介鏈酶活性，與隨從鏈的模板DNA結(jié)合，沿5′→3′方向移動，還有一種叫做Rep蛋白和前導(dǎo)鏈的模板DNA結(jié)合沿3′→5′方向移動。解鏈酶的作用就是打開DNA雙鏈之間的氫鍵。

2.單鏈結(jié)合蛋白：(single strand binding proteins,SSBP)

它與解開的單鏈DNA結(jié)合，使其穩(wěn)定不會再度螺旋化并且避免核酸內(nèi)切酶對單鏈DNA的水解，保證了單鏈DNA做為模板時的伸展?fàn)顟B(tài)，SSBP可以重復(fù)利用(圖16－8)。

圖16-8　大腸桿菌DNA復(fù)制叉中復(fù)制過程簡圖

3.引發(fā)體的形成：

DNA復(fù)制起始的關(guān)健步驟是前導(dǎo)鏈DNA的合成，一旦前導(dǎo)鏈DNA的聚合作用開始，隨從鏈DNA的合成也隨著開始。由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進行的，所以它的起始相對簡單，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進行的，所以引發(fā)階段比較復(fù)雜。大腸桿菌的引發(fā)前體由Dna B. Dna C和單鏈結(jié)合蛋白組成。

(1)引物酶(primase)

它是一種特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。這種短RNA片段一般十幾個至數(shù)十個核苷酸不等，它們在DNA復(fù)制起始處做為引物。RNA引物的3′桹H末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一個磷酸二酯鍵的位置。

(2)引發(fā)體(primosome)

高度解鏈的模板DNA與多種蛋白質(zhì)因子形成的引發(fā)前體促進引物酶結(jié)合上來，共同形成引發(fā)體，引發(fā)體主要在DNA隨從鏈上開始，它連續(xù)地與引物酶結(jié)合并解離，從而在不同部位引導(dǎo)引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3′桹H末端接下去合成DNA片段，這就是隨從鏈不連續(xù)合成的開始。