《臨床生物化學(xué)》 三、核酸限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析

RFLP分析是限制性內(nèi)切酶、核酸電泳、印跡（blot）技術(shù)、探針-雜交技術(shù)的綜合應(yīng)用，多用于臨床遺傳性疾病的基因診斷?；驹硎沁z傳性疾病多有基因的缺陷，如基因缺失、基因插入、編碼區(qū)小范圍核苷酸序列改變或點(diǎn)突變等。前二者可將純化的正常人和病人DNA同時(shí)用限制性內(nèi)切酶切成片段，經(jīng)電泳分離、印跡、探針雜交等找到目的基因。由于患者基因的缺失或插入，造成被限制性內(nèi)切酶切開的片段（分子量）大小與正常人發(fā)生差異（限制性片段長度多態(tài)），使其電泳遷移率發(fā)生差異，而達(dá)到基因診斷的目的。小區(qū)域或點(diǎn)突變，可選用一個(gè)限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)正好在這一變異位置，使切割作用和正常人發(fā)生差異（如正常人基因可切斷而患者不能，或反之），達(dá)到診斷目的?，F(xiàn)在PCR產(chǎn)物經(jīng)變性為DNA單鏈，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，只要有一個(gè)核苷酸發(fā)生變異，其電泳遷移率就會(huì)改變，進(jìn)行多態(tài)分析（PCR-SSCP）。實(shí)際上把基因的異常位置設(shè)計(jì)在PCR擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)，就能進(jìn)行多態(tài)分析。（圖18-8）

核酸純化→內(nèi)切酶作用→電泳分離→Southern blot→探針-雜交→顯影，顯色

圖18-8　點(diǎn)突變Eco R1RFL