好，標(biāo)記量大，雜交檢出信號強(qiáng)。合成探針長度短，一般在20-50核苷酸之間，過長合成成本高，且易出現(xiàn)聚合酶合成錯誤，雜交時間長。太短則特異性下降。合成探針設(shè)計還應(yīng)注意堿基組成G≡C含40％-60％，一種堿基連續(xù)重復(fù)不超過4個，以免非特異性雜交產(chǎn)生。還要注意探針自身序列內(nèi)應(yīng)無互補(bǔ)區(qū)域以免產(chǎn)生“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，影響雜交。一個好的探針最終在實(shí)踐中才能加以確認(rèn)。另外，還有利用M13噬菌體載體可復(fù)制單鏈DNA的特點(diǎn)，復(fù)制合成DNA探針，利用轉(zhuǎn)錄載體（DNA），轉(zhuǎn)錄合成RNA探針。下面就GIBCoBRL公司（Bethesda Research Laboratories美國）的缺口平移法標(biāo)記生物素試劑盒（bionick labeling system）為例介紹如下：
試劑：10x dNTP Mix.250μl10x Enzyme Mix 250μl0.2mmol/L each dCTP，dCTP，dTTP0.5 units/μl DNA Polymerase Ⅰ0.1mmol/L dATP0.0075 units/μl DNase Ⅰ0.1mmol/L biotin-14-dATP50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)500mmol/L Tris-HCl(pH7.8)5mmol/L magnesium acetate50mmol/L MgCl21mmol/L β-mercaptoethanol100mmol/L β-mercaptoethanol0.1mmol/L phenylmethyl-sulfonyl fluoride100μg/ml nuclease-free BSA50％（v/v）glycerol100μg/ml nuclease-free BSAControl DNA：5μg pBR322 in TEstop buffer 300 mM EDTAautoclaved H2O
探針制備就是目的基因的標(biāo)記，核酸標(biāo)記方法常用的有缺口平移法、隨機(jī)引物法、末端標(biāo)記法等。標(biāo)記物質(zhì)有放射性元素（如32P等）和非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸標(biāo)記同位素，被標(biāo)記的dNTP本身就帶有磷酸基團(tuán)，便于標(biāo)記，特點(diǎn)是比活性高，可達(dá)9000Ci/mmol；發(fā)射的β射線能量高，可達(dá)1.70MeV，用它標(biāo)記的探針自顯影時間短，靈敏度高。32P的半壽期為14天，應(yīng)隨標(biāo)隨用，一般標(biāo)記后，在一周內(nèi)使用，它雖帶來不便，但給使用后廢棄物處理減輕了壓力。使用32P標(biāo)記物應(yīng)注意防護(hù)，操作時應(yīng)有1-1.5cm厚聚甲基丙烯酸甲酯有機(jī)玻璃隔離保護(hù)，避免直接照射。操作人員胸前應(yīng)佩帶個人計量器，定期檢測。結(jié)束實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)用專用探測器（蓋革-米勒檢測器），檢查工作區(qū)域、手、衣服等，以免污染發(fā)生。其它同位素標(biāo)記物，同樣應(yīng)注意放射線防護(hù)。
非放射性標(biāo)記有酶標(biāo)和化學(xué)物標(biāo)記法。酶標(biāo)方法與免疫測定ELISA方法相似，只是被標(biāo)記的核酸代替了被標(biāo)記的抗體，事實(shí)上被標(biāo)記的抗體也稱為探針，閱讀文獻(xiàn)時應(yīng)加以注意。現(xiàn)有許多商品是生物素（biotin）、地高辛標(biāo)記的，如生物素-dUTP、生物素-dATP、地高辛-dUTP等。血凝素（avidin）與生物素有非常高的親和性，當(dāng)血凝素標(biāo)記上過氧化物酶或堿性磷酸酶（血凝素-酶），經(jīng)雜交反應(yīng)最終形成：探針-生物素-血凝素-酶復(fù)合物（ABC法）。酶催化底物顯色，觀察結(jié)果。與一般的酶反應(yīng)底物不同，ABC法底物顯色后為不溶物，以便觀測結(jié)果。酶標(biāo)記法復(fù)雜、重復(fù)性差、成本高，但便于運(yùn)輸保存，靈敏度與放射物標(biāo)記相當(dāng)。化學(xué)物標(biāo)記有的也是利用相應(yīng)酶標(biāo)抗體形成特異復(fù)合物，與上述方法相當(dāng)，有的則可自發(fā)光。化學(xué)標(biāo)記法簡單、成本低，但靈敏度相對較低。（表18-1）
表18-1 探針標(biāo)記及特性
標(biāo)記物檢測方法特點(diǎn)32Pβ射線，自顯影靈敏度最高，半壽期14天，放射強(qiáng)度1.7MeV35Sβ射線，自顯影靈敏度高，分辨率好，半壽期87天，0.17MeV3Hβ射線，自顯影低敏度高，分辨率高，半壽期12年，0.01MeV125Iγ射線，自顯影靈敏度高，分辨率高，半壽期60天，0.04MeV生物素酶標(biāo)血凝素，顯色靈敏度好，避免有內(nèi)源性生物素標(biāo)本地高辛酶標(biāo)地高辛配體，顯色靈敏度好，分辨率一般T-T二聚體酶標(biāo)抗二聚體抗體，顯色靈敏度好，紫外照射形成二聚體而標(biāo)記BrdU酶標(biāo)抗BrdU抗體，顯色靈敏度好，細(xì)菌內(nèi)含質(zhì)粒復(fù)制摻入銪-補(bǔ)骨脂素?zé)晒忪`敏度一般缺口平移標(biāo)記法先由DNase Ⅰ在DNA雙鏈上切出隨機(jī)切口，DNA聚合酶Ⅰ沿缺口水解5′端核苷酸和3′端修復(fù)加入被標(biāo)記核苷酸同時進(jìn)行，切口平行推移，可均一標(biāo)記DNA鏈。（圖18-4、5）
缺口平移法快速、簡便、成本相對較低、比活性較高、標(biāo)記均一。主要利用了DNA聚合酶Ⅰ修復(fù)DNA的功能，用于大分子DNA標(biāo)記（＞1000bp最好），單鏈DNA、RNA不能用該法標(biāo)記。隨機(jī)引物法具有上述優(yōu)點(diǎn)，可代替缺口平移法。此外大小、單雙DNA均可標(biāo)記，標(biāo)記均勻，標(biāo)記率高，但不能標(biāo)記環(huán)狀DNA。利用末端轉(zhuǎn)移酶可進(jìn)行“尾標(biāo)”，尾標(biāo)適用于寡核苷酸探針標(biāo)記，用于大分子核酸標(biāo)記因尾巴短而標(biāo)記比活性降低。尾標(biāo)不能用dTTP標(biāo)記，因mRNA的多聚（A）尾而影響雜交特異性。寡核苷酸探針多用于核酸“點(diǎn)”突變檢測，該探針可用核酸合成儀人工合成?？寺√结樢话爿^長，特異性
圖18-5 DNA隨機(jī)引物標(biāo)記法
好，標(biāo)記量大，雜交檢出信號強(qiáng)。合成探針長度短，一般在20-50核苷酸之間，過長合成成本高，且易出現(xiàn)聚合酶合成錯誤，雜交時間長。太短則特異性下降。合成探針設(shè)計還應(yīng)注意堿基組成G≡C含40％-60％，一種堿基連續(xù)重復(fù)不超過4個，以免非特異性雜交產(chǎn)生。還要注意探針自身序列內(nèi)應(yīng)無互補(bǔ)區(qū)域以免產(chǎn)生“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，影響雜交。一個好的探針最終在實(shí)踐中才能加以確認(rèn)。另外，還有利用M13噬菌體載體可復(fù)制單鏈DNA的特點(diǎn)，復(fù)制合成DNA探針，利用轉(zhuǎn)錄載體（DNA），轉(zhuǎn)錄合成RNA探針。下面就GIBCoBRL公司（Bethesda Research Laboratories美國）的缺口平移法標(biāo)記生物素試劑盒（bionick labeling system）為例介紹如下：
試劑：10x dNTP Mix.250μl10x Enzyme Mix 250μl0.2mmol/L each dCTP，dCTP，dTTP0.5 units/μl DNA Polymerase Ⅰ0.1mmol/L dATP0.0075 units/μl DNase Ⅰ0.1mmol/L biotin-14-dATP50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)500mmol/L Tris-HCl(pH7.8)5mmol/L magnesium acetate50mmol/L MgCl21mmol/L β-mercaptoethanol100mmol/L β-mercaptoethanol0.1mmol/L phenylmethyl-sulfonyl fluoride100μg/ml nuclease-free BSA50％（v/v）glycerol100μg/ml nuclease-free BSAControl DNA：5μg pBR322 in TEstop buffer 300 mM EDTAautoclaved H2O操作步驟：
將5μl 10x dNTP Mix.；－μl DNA（相當(dāng)1μg需標(biāo)記的DNA量）；－μl滅菌蒸餾水加至45μl；再加5μl10x Enzyme Mix.依次加入1.5-2ml離心管后。15000xg離心15秒鐘。16℃保溫1小時。加5μl Stop Buffer終止反應(yīng)。乙醇沉淀，備用。