《臨床生物化學(xué)》 五、溫度的控制

要了解此問(wèn)題，應(yīng)注意溫度對(duì)酶活性影響的雙重性。首先，化學(xué)速度隨溫度升高而加快，酶反應(yīng)也不例外。Q10值即溫度增加10℃，化學(xué)速度的變化率。酶的Q10值約在1.5-2.5之間。

溫度與反應(yīng)速度之間關(guān)系，可用Arrhenius方程式來(lái)表示：

Logk＝－E/2.303RT+常數(shù)

式中k是反應(yīng)常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，R為氣體常數(shù)。E為活化能也是常數(shù)。在酶反應(yīng)中V＝K·[E]。所以在酶反應(yīng)中，LogV和1/T作圖為一直線，斜率為－E/2.303R。通過(guò)每一直線斜率不難計(jì)算出該酶反應(yīng)的活化能E。

但是，測(cè)定酶時(shí)都需要酶和底物在一定溫度下作用一段時(shí)間，在此期間，溫度有可能使酶失活，不同酶在此方面差異很大，有些酶如胎盤(pán)堿性磷酸酶在56℃放置15分鐘，活性也不下降，有些酶如酸性磷酸酶，37℃1小時(shí)后，失去50％酶活性。酶的穩(wěn)定性還與其它因素，如作用時(shí)間、pH、有無(wú)底物、有無(wú)其它蛋白等有關(guān)。同為堿性磷酸酶，在肝提取液中遠(yuǎn)不如血清中穩(wěn)定，37℃作用15分鐘后肝中此酶活性將顯著下降。又如將血清pH降低在pH6.0以下，血清中酸性磷酸酶將長(zhǎng)期穩(wěn)定。

圖17-5　預(yù)溫15分（37℃，pH9.9）對(duì)ALP活性的影響

○與●表示肝ALP活性不預(yù)溫和預(yù)溫的變化

△與▲表示血清ALP活性不預(yù)溫和預(yù)溫的變化

圖17-5形象說(shuō)明預(yù)溫過(guò)程對(duì)酶活性的影響。

目前常規(guī)工作實(shí)驗(yàn)室越來(lái)越多的使用37℃，一些國(guó)家已明確推薦使用此溫度。這更多地是從實(shí)際工作方便來(lái)考慮。因?yàn)闇囟壬?，反?yīng)速度快，靈敏度高。同時(shí)延滯時(shí)間和測(cè)定時(shí)間都可能縮短。從而有利于提高工作效率。尤其目前在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用全自動(dòng)生化分析儀，有高效率的恒溫系統(tǒng)，使反應(yīng)系統(tǒng)很快升溫并維持在37℃，可避免溫度差異引起的誤差。但在37℃時(shí)，不可避免地一些酶可能失活。

早期曾推薦使用25℃為酶測(cè)定溫度，其優(yōu)點(diǎn)為接近室溫，反應(yīng)體系溫度很容易平衡到此溫度，這對(duì)于當(dāng)時(shí)使用無(wú)有效控溫系統(tǒng)的分光光度計(jì)來(lái)測(cè)酶活化性有其特別方便之處。但溫度低。反應(yīng)太慢。在有些溫?zé)岬貐^(qū)，當(dāng)室溫超過(guò)25℃時(shí)，還需使用降溫系統(tǒng)很不方便。因此目前已很少有實(shí)驗(yàn)室采用此溫度。

IFCC推薦的30℃，兼顧了上述二溫度的優(yōu)點(diǎn)，即保證了一定的反應(yīng)速度。又無(wú)酶失活之?dāng)_，此外還有一個(gè)上述二溫度沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)，即可以鎵作為此溫度的基準(zhǔn)物質(zhì)，純鎵的熔點(diǎn)為29.77℃。保證了測(cè)定系統(tǒng)計(jì)30℃的高度準(zhǔn)確性，而37℃和25℃至今尚無(wú)一個(gè)最準(zhǔn)確的確定方法。

30℃和37℃是目前使用最廣泛的二種測(cè)定酶的使用的溫度。在比較不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果時(shí)，一定要注意由此引起來(lái)的差異，否則將導(dǎo)致臨床診斷的困難和誤差。一些作者提出使用二溫度間的轉(zhuǎn)換系數(shù)使二溫度測(cè)定結(jié)果的比較變?yōu)榭杀?。雖然一些作者持懷疑態(tài)度，用一個(gè)系數(shù)能代表所有標(biāo)本中的變化情況嗎？最新研究證實(shí)只要所用方法合適，人類(lèi)血清中酶對(duì)溫度變化的反應(yīng)差異不大，在無(wú)法統(tǒng)一溫度情況下，這還不失為一權(quán)宜之計(jì)，常用酶的溫度轉(zhuǎn)換系數(shù)可參見(jiàn)表17-4：

表17-4　常見(jiàn)酶溫度轉(zhuǎn)化系數(shù)

25℃30℃37℃CK0.641.001.56LD0.751.001.44ALT0.761.001.38AST0.731.001.52ALP0.781.001.30GGT0.731.001.31CHE0.811.001.26HBDH0.851.001.10

不論選用何種溫度測(cè)酶，由于酶反應(yīng)受溫度影響很大，在測(cè)定時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)體系的溫度變化應(yīng)控制在±0.1℃內(nèi)。應(yīng)用國(guó)產(chǎn)普通恒溫水浴箱來(lái)測(cè)酶活性是不合適的，應(yīng)使用帶有攪拌器的高級(jí)恒溫水浴。