《臨床生物化學(xué)》 五、免疫方法測(cè)酶質(zhì)量的臨床應(yīng)用

用免疫學(xué)方法測(cè)酶質(zhì)量和經(jīng)典的測(cè)酶活性方法相比，不僅靈敏度高，并可能測(cè)定一些以前不易測(cè)定的酶。但更為有意義的是：有可能為臨床上的應(yīng)用提供新的資料和信息。從疾病論斷的角度來(lái)看，至少提供下列三個(gè)新的可能性：

（一）酶活性和酶質(zhì)量變化的不平行

這二者的變化在不少情況下是互相平行的，但在一些情況下可以出現(xiàn)不一致。早在1987年Robert就提出可以用免疫學(xué)方法直接測(cè)量CK的質(zhì)量，并聲稱(chēng)：“由于RIA法是如此的敏感，并可測(cè)定血循環(huán)中無(wú)活性的CK-MB，毫不奇怪此法可比其它方法更早查出心肌梗死，一般在疼痛3小時(shí)就可升高?！贝撕笥行W(xué)者在急性心肌梗死時(shí)比較測(cè)CK-MB活性和RIA法CK-B亞單位的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者之間存在著不平行關(guān)系。CK-MB活性升高持續(xù)較短，3天左右；而CK-B亞單位酶蛋白升高卻在7天左右。近幾年來(lái)發(fā)展了用免疫學(xué)方法測(cè)CK-MB酶質(zhì)量（mass）方法與測(cè)酶活性（activity）方法的結(jié)果相比較，在檢測(cè)心肌壞死上，測(cè)質(zhì)量方法明顯優(yōu)于測(cè)活性方法。

國(guó)內(nèi)有人報(bào)告了用單擴(kuò)法測(cè)酶活性的方法，測(cè)定了在各種患者血中超氧歧化酶（SOD）含量，證實(shí)有些患者血中存在著無(wú)活性的SOD。

在一些疾病情況下，甚至出現(xiàn)二者變化完全相反的情況。例如在狗實(shí)驗(yàn)性胰腺炎，用免疫學(xué)方法測(cè)彈性蛋白酶濃度，出現(xiàn)迅速而急劇地上升，但同時(shí)酶活性卻出現(xiàn)平行地下降。作者解釋在釋放酶蛋白入血同時(shí)，有大量酶抑制劑也釋放入血，以致出現(xiàn)相互矛盾結(jié)果。前面提到的用兩種方法測(cè)前列腺酸性磷酸酶（PACP）來(lái)診斷前列腺癌的陽(yáng)性率不一致，有作者也認(rèn)為可能是腫瘤組織合成一些無(wú)活性或活性較低的酸性磷酸酶。

如果說(shuō)在這方面尚有爭(zhēng)論，那么在遺傳學(xué)方面的意義則是比較明確的，將此兩大類(lèi)方法結(jié)合起來(lái)可以研究酶缺陷遺傳疾病的發(fā)生機(jī)制，用免疫學(xué)方法可以測(cè)出滅活的酶蛋白量。由于基因缺陷引起的酶缺陷如果僅僅影響酶蛋白合成下降，酶活性與酶蛋白量的比率即所謂的“免疫比活性”無(wú)變化；如果由于基因缺陷合成了變異的酶蛋白，則不僅總酶活性下降，免疫比活性也將變化；如果合成了一種活性正常但結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的酶，則幼稚細(xì)胞中酶活性及質(zhì)量都無(wú)變化，而在衰老細(xì)胞中將出現(xiàn)酶缺陷。酶穩(wěn)定性的變異常見(jiàn)于紅細(xì)胞內(nèi)酶缺陷癥。這是由于紅細(xì)胞壽命較長(zhǎng)，成熟紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核不能制造新蛋白質(zhì)，所以酶穩(wěn)定性的缺陷容易在衰老紅細(xì)胞中表現(xiàn)出來(lái)。

在最嚴(yán)重的情況，變異的基因甚至能合成無(wú)活性的酶蛋白，如膽堿酯酶遺傳變異中，有一類(lèi)型所謂“不活動(dòng)等位基因”（“silent”allele）就是典型例子。又如在Lesch-Nyhau綜合征中存在這免疫活性但無(wú)催化活性的次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶。

（二）以免疫方法取代測(cè)酶活性方法

免疫學(xué)方法和經(jīng)典測(cè)酶活性方法相比最突出的優(yōu)點(diǎn)是：免疫學(xué)方法能測(cè)定一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白質(zhì)，這在以前是不能想象的。首先是各種酶原，還有去輔基酶蛋白（apoenzyme）以及一些滅活的酶蛋白裂解產(chǎn)物等等。例如已有用RIA法測(cè)胰蛋白酶原。也有用免疫學(xué)方法測(cè)定線粒體和胞質(zhì)谷草轉(zhuǎn)氨酶，這其中包括無(wú)酶活性的去輔基谷草轉(zhuǎn)氨酶。

免疫學(xué)方法另一特點(diǎn)是特異性高，且不受體液中其它物質(zhì)，特別是抑制劑、激活劑的干擾。不少蛋白水解酶或者對(duì)基質(zhì)特異性不高，或者易受血中一些蛋白質(zhì)如α1-抗胰蛋白酶、α２－巨球蛋白的抑制作用。用測(cè)酶活性方法不易準(zhǔn)確定量甚至無(wú)法測(cè)定。在近年來(lái)用免疫學(xué)方法陸續(xù)建立了RIA測(cè)胰蛋白酶、彈性蛋白酶的方法。

一般說(shuō)來(lái)和測(cè)酶活性相比，免疫學(xué)方法靈敏度更高一些。一些既往由于方法學(xué)靈敏度差，不易測(cè)定的酶可以嘗試改用免疫學(xué)方法，脂肪酶是其中例子之一。經(jīng)典測(cè)酶活性方法由于靈敏度差，酶溫育時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)，幾經(jīng)修改仍需4小時(shí)，現(xiàn)已有RIA法脂肪酶試劑盒。近年來(lái)隨著優(yōu)生學(xué)發(fā)展，羊水中各種成分包括酶的測(cè)定日益受到重視。例如在Tay-Sachs綜合征時(shí)，胚胎組織細(xì)胞中氨基已糖苷同工酶A或（和）B合成障礙，免疫學(xué)方法由于靈敏度高，可以比測(cè)酶活性方法早幾周在胎兒的羊水中查出此酶的缺陷。

（三）同工酶測(cè)定

免疫學(xué)方法用于測(cè)定同工酶比經(jīng)典的理化方法簡(jiǎn)單方便，所以愈來(lái)愈多同工酶測(cè)定改用免疫學(xué)方法，國(guó)外已逐步取代電泳或?qū)游龇?。除上文已提到的CK-MB、LD1、LD5測(cè)定外，還可用免疫學(xué)方法測(cè)半乳糖?；D(zhuǎn)移酶同工酶A和B，堿性磷酸酶的Regan同工酶。同工酶有可能作為腫瘤的標(biāo)記物（tumor marker），已證實(shí)γγ-烯醇化酶或神經(jīng)元特異烯醇化酶（NSE）可作為APUD系統(tǒng)腫瘤的一個(gè)很好標(biāo)記物。用RIA測(cè)血中NSE在肺小細(xì)胞性腫瘤患者中陽(yáng)性率超過(guò)80％，γγ-烯醇化酶在大細(xì)胞肺癌陽(yáng)性率也超過(guò)70％?？梢灶A(yù)期隨科學(xué)技術(shù)發(fā)展，免疫學(xué)方法將成為臨床上測(cè)定同工酶的主要方法。

六、檢測(cè)同工酶及其亞型的臨床意義

從50年代中期開(kāi)始，臨床酶學(xué)有了迅速的發(fā)展，幾乎把當(dāng)時(shí)能測(cè)的酶都在臨床上試用過(guò)，企圖通過(guò)測(cè)定某一種或某幾種酶來(lái)診斷一些特定疾病或特定組織器官的病變。通過(guò)10余年廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)酶測(cè)定診斷疾病的特異性并不高，因?yàn)闄C(jī)體中各種細(xì)胞的代謝有很大的相似性，從臨床角度很難說(shuō)存在著所謂器官特異酶。當(dāng)時(shí)曾有學(xué)者想找出一些腫瘤特異酶，但很快發(fā)現(xiàn)找不到一種只存在于腫瘤組織并能進(jìn)入血液而正常組織又不存在的酶。

在此同時(shí)，Market等通過(guò)對(duì)LD在電泳時(shí)可分為5個(gè)區(qū)帶的深入研究，在1959年首先提出“isozyme”的術(shù)語(yǔ)來(lái)描述一類(lèi)酶，它們催化同一生化反應(yīng)，但在結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上有所不同，目前廣泛使用國(guó)際生化協(xié)會(huì)推薦術(shù)語(yǔ)“isoenzyme”。我國(guó)目前多翻譯為同工酶，臨床很快將此新概念、新發(fā)現(xiàn)用于臨床，發(fā)現(xiàn)同工酶測(cè)定可以彌補(bǔ)上述測(cè)酶總活性的不足之處，因?yàn)椴煌っ冈诮M織分布、細(xì)胞內(nèi)定位、發(fā)生發(fā)育方面都可能有所差異，臨床可利用這些差異來(lái)增加診斷的特異性。目前不論在診斷腫瘤，還是診斷心臟、肝等疾病上都找到一些較總酶活性測(cè)定特異性、靈敏度高的同工酶測(cè)定項(xiàng)目，同工酶正逐步成為酶學(xué)中一個(gè)重要分支。

80年代發(fā)現(xiàn)某些同工酶從組織進(jìn)入體液后，進(jìn)一步變化分為數(shù)個(gè)不同類(lèi)型即所謂同工酶的亞型（isoform）。CK-MB的亞型MB1、MB2，CK-MM亞型MM1、MM2和MM3在AMI的診斷和溶栓療效判斷上都優(yōu)于總酶和同工酶。

同工酶是一個(gè)復(fù)雜的生物現(xiàn)象，至今在分類(lèi)、概念上尚有一些問(wèn)題有待研究澄清。從臨床診斷角度可將同工酶理解為一個(gè)包括有多種能催化相同生化反應(yīng)的酶族，在這族中雖然不同酶都催化同一反應(yīng)，但在理化性質(zhì)上有差異，如它們對(duì)底物的親和性、特異性不同，對(duì)抑制劑出現(xiàn)不同的反應(yīng)，所帶電荷、對(duì)熱耐受性有差異等等。生化學(xué)者根據(jù)這些差異用各種物理、化學(xué)方法將同工酶分離測(cè)定，從本質(zhì)上說(shuō)這些差異與酶蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)，或者是構(gòu)成酶蛋白的氨基酸在組成或排列次序上出現(xiàn)差異，或者由于二級(jí)、三級(jí)乃至四級(jí)結(jié)構(gòu)不同而造成上述不同的理化性質(zhì)，同時(shí)這些結(jié)構(gòu)差異又可引起酶蛋白抗原性的差異。目前正在大力發(fā)展這種用免疫方法測(cè)同工酶的技術(shù)，并取得明顯進(jìn)展。

同工酶之所以有較高的診斷價(jià)值與下面一些因素有關(guān)：

首先是某些同工酶有明顯的組織分布差異，以目前臨床應(yīng)用最多的CK和LD同工酶而言，CK大量存在于三種肌肉組織中，單獨(dú)總CK升高很難判斷。CK升高的組織來(lái)源為：骨骼肌中主要為CK-MM，平滑肌中為CK-BB，心肌中雖然大多數(shù)仍是CK-MM，但卻含有14％-40％的其它兩種肌組織中沒(méi)有或僅含少量的CK-MB，這樣只要能測(cè)CK同工酶，根據(jù)同工酶變化，不難判斷出釋放CK的器官或組織。

LD雖然幾乎存在于全身各種細(xì)胞中，但其五種同工酶在體內(nèi)分布情況并不相同。如LD1主要存在于心肌和紅細(xì)胞中，LD5則主要存在于肝臟和骨骼肌中，正常血清中同工酶分布為L(zhǎng)D2＞LD1＞LD3＞LD4＞LD5，這樣雖然心臟和肝的多種疾病都能引起總LD升高，但對(duì)血清LD同工酶影響卻大不相同。如AMI時(shí)，LD1明顯增高以致LD1＞LD2，肝病時(shí)將出現(xiàn)LD5＞LD4，AMI患者在LD1＞LD2基礎(chǔ)上，又同時(shí)出現(xiàn)LD5＞LD4，可懷疑是否有右心衰竭，引起肝淤血。有些酶的同工酶與上述情況不同，只是細(xì)胞內(nèi)定位不同，臨床上有診斷意義的主要是線粒體同工酶，線粒體中有一些酶在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上往往與細(xì)胞質(zhì)中同工酶有明顯差異，臨床應(yīng)用較多的是線粒體AST。輕度病變時(shí)，由于線粒體有兩層致密的膜，此同工酶很難進(jìn)入血清，但在細(xì)胞壞死病變時(shí)，血清中線粒體同工酶常明顯升高。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)ALT也存在著兩種同工酶，肝臟疾病時(shí)ALT經(jīng)常升高，ALT同工酶測(cè)定應(yīng)該對(duì)肝病預(yù)后判斷有一定價(jià)值。

在胚胎期，和器官的發(fā)生發(fā)育一樣，這一時(shí)期酶帶有早期種族進(jìn)化的痕跡，與出生后人體的酶往往有差異。當(dāng)人得腫瘤后，腫瘤細(xì)胞可以出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，有可能出現(xiàn)胚胎期同工酶，測(cè)定這類(lèi)同工酶有助于診斷腫瘤，例如胚胎期CK主要為CK-BB，約有10％惡性腫瘤患者血清可查出CK-BB，又如一些腫瘤患者血中可查到胎盤(pán)性ALP等等。

總之，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，測(cè)定項(xiàng)目的增加，測(cè)定方法的簡(jiǎn)化，同工酶測(cè)定將在診斷疾病、判斷療效和預(yù)后方面起著愈來(lái)愈大的作用。